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酪氨酸酶活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1806

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品簡介：

酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶，是具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、 酵母和動物組織中。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，也是引起果蔬酶促褐變的主要因素，同時也對昆蟲 的免疫及生長有重要影響。

酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，進而測定出酪氨酸酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每瓶加入15mL提取液充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）：直接檢測。

二、測定操作

1. 分光光度計預(yù)熱30min，波長調(diào)至475nm。蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表（在1mL玻璃比色皿中分別加入）

充分混勻后立即測定10s時在475nm下的吸光度，記為A1，之后迅速將其放入37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴或培養(yǎng)箱中3min。然后迅速拿出擦凈后測定190s時的吸光度，記為A2。計算ΔA=A2-A1。

三、酪氨酸酶酶活計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。

酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。

酪氨酸酶（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(W÷V提取×V樣)÷T=90.09×ΔA÷W

3. 按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算：

單位的定義：每10⁴個細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。

酪氨酸酶（U/10⁴cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(500÷V提取×V樣)÷T=0.18×ΔA

4. 按血清（漿）體積計算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。

酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=90.09×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，10^-3L；ε：多巴色素的摩爾消光系數(shù)：3.7×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹： 單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V樣：加入的樣本體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V提?。禾崛∫后w積，1mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，3min。

注意事項： 

1. 當(dāng)ΔA大于0.3時，建議將樣本用提取液稀釋后測量；ΔA過小時，建議增加酶促反應(yīng)時間（5min或10min）或增加加入的樣本體積來測定。

2. 試劑一溶解后易氧化。溶解后盡快用完。