RIPA 裂解液(強)

產(chǎn)品貨號：T0013B

產(chǎn)品包裝：50ml/100ml/500ml

產(chǎn)品簡介：

  多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液（強）(RIPA Lysis Buffer) 是采用一種經(jīng)典的細(xì)胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液，其裂解強度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中)。 所獲得的蛋白質(zhì)可用于 Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。

  Medium RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分， 可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成：

操作步驟（僅供參考）：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清， 留取沉淀。

3. 按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 RIPA Lysis Buffer。移液器輕輕吹打， 使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于細(xì)胞 1～3s 內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～ 250μl。

4. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5. 后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2. 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3. 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Weak RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大 裂解液的用量到 200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

4. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5. 進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1. 取 Enhanced Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻后，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2. 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨， 研磨過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

3. 按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 15～30min。

4. 步驟 3、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以 減少蛋白的降解。

5. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

6. 進行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2. 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3. 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的 細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分。然 后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。

5. 溶解 RIPA Lysis Buffer 時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免有效成分失效。

6. 裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復(fù)合物。在 不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和 基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。 如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如 NF-KB、p53 等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因 子。

7. 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進行。

有效期： 12 個月有效。