His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）

產(chǎn)品貨號(hào)：26421（5ml）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）包含Ni-Agarose填料、親和柱空柱以及可溶性His融合蛋白純化所需的全部試劑（細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分），使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4個(gè)Ni²⁺螯合位點(diǎn)，較只有3個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA結(jié)合Ni²⁺ 更為牢固，有效防止純化過(guò)程中Ni²⁺脫落且增強(qiáng)對(duì)His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力，提高純化效率。較高的基團(tuán)密度，大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下，對(duì)來(lái)源于各種表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒，哺乳細(xì)胞，酵母以及細(xì)菌）中的His標(biāo)簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便，快捷。

支持物： CL-6B瓊脂糖凝膠

載量： 20-30 mg His標(biāo)簽蛋白/ml填料

粒徑： 50-160 µm

產(chǎn)品內(nèi)容：

操作步驟：

Ⅰ緩沖液的準(zhǔn)備    

可溶性蛋白純化緩沖液配方：

Ⅱ組裝層析柱

1. 將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后， 把底部的出液口打開(kāi)，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。

注意：

1）填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mg His標(biāo)簽蛋 白計(jì)算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(gè)外力，例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。

3）本實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)重力作用使溶液流出。

2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

注意：柱體積指的是填料的體積。

Ⅲ可溶性蛋白的純化

1. 收集菌體后，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 ml細(xì)菌裂解液（每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。

注意：

1）當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時(shí)，建議加入DNase I和Lysozyme。每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1 μl DNase I（1,000 U/ml），2 μl Lysozyme（50 mg/ml）。

2）超聲過(guò)程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實(shí)驗(yàn)中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，可分成短時(shí)間，多次超聲，通過(guò)一定的間隔時(shí)間避免溶液過(guò)熱。最終菌液變清即可。

2. 10000 rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。

3. 用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液。

注意：

1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時(shí)先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過(guò)濾，防止過(guò)多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。

2）通過(guò)控制加入的菌體裂解液的速度來(lái)控制流速。

4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。

5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

  注意：洗脫峰可以分管收集，每1 ml收集1管，并采用蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)，收集洗脫峰

6. 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），封柱后2-8℃保存。

  注意：如果是分段梯度洗脫，最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500 mM時(shí)，則使用濃度為500 mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后，再進(jìn)行第6步的操作

Ⅳ柱再生

當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色）， 可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

1. 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后，使用3倍柱體積的去離子水沖洗。

2.  使用1倍柱體積的2% SDS沖洗。

3.  依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5倍柱體積的100%乙醇沖洗，再依次使用1倍柱體積的75%、

50%和25%的乙醇沖洗。

4. 使用1倍柱體積的去離子水沖洗。

5.  使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液（PH8.0）沖洗。

6.  使用3倍柱體積去離子水，3倍柱體積20%乙醇沖洗。

7.  2-8°C保存。

8. 再次使用前，需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個(gè)柱體積的50 mM NiSO₄再生，3個(gè)柱體積的Binding Buffer平衡。

注意事項(xiàng)：

1. 在純化之前采用電泳檢測(cè)蛋白的可溶性，本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化。

2. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT和EDTA。

3. 整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。

4. 為提高純化效率，首先確定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，Binding Buffer的范圍為0-10 mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來(lái)進(jìn)行。并通過(guò)SDS-PAGE或Western Blotting來(lái)檢測(cè)目的蛋白的純度。

5. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過(guò)0.22µm或者0.45µm過(guò)濾器過(guò)濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.22µm或者0.45µm過(guò)濾器過(guò)濾。

6. 柱再生時(shí)，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。