組織線粒體分離試劑盒產(chǎn)品貨號：10262產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T產(chǎn)品簡介：線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場所，細(xì)胞活動所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化所產(chǎn)生的能量來供應(yīng)。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級分離法獲得，即先低俗出去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片，再進(jìn)行高速梯度離心分離線粒體。尚寶生物 組織線粒體分離試劑盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離動物組織中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。該試劑盒可用于從動物軟組織(如腦、肝臟)和硬組織(心肌、骨骼肌)中提取線粒體，對于采用該試劑盒提取硬組織線粒體效果不佳者，建議采用 尚寶生物硬組織線粒體分離試劑盒。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。產(chǎn)品組成：試劑名稱 50T 100T 保存條件試劑(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml 200ml -20℃試劑(B): Mitochondria Stock buffer 10ml 20ml -20℃試劑(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml 20ml 室溫試劑(D): PMSF(100×) 1.5ml 3ml -20℃自備材料：1. 低溫離心機(jī)、勻漿器2. PBS操作步驟：1. 清洗：取新鮮組織(不宜采用凍存的組織)，迅速稱重50～100mg，用預(yù)冷的PBS清洗1次，冰上剪成3mm2大小的組織碎片。2. 勻漿裂解：加入10倍體積的預(yù)冷的Mitochondria Lysis buffer(如需獲得細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)提前加入PMSF，至PMSF濃度為1×)，置于冰浴上Dounce勻漿器中，勻漿10～20次。 不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。3. 離心：4℃，600g離心5min以去除細(xì)胞核、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為2000g離心3min，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。4. 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃12000g離心10min。注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為6000g離心10min，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。5. 棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12000g，4℃離心10min，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。6. 保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于Mitochondria Stock buffer；如果用于線粒體蛋白的分析，獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于1×Protein Stock buffer，即按細(xì)胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸Ｗ⒁馐马?xiàng)：1. 試劑 (如 PMSF)對于不同實(shí)驗(yàn)不必全部使用，在實(shí)驗(yàn)條件成熟后可以不必使用。2. 如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 不必加入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入，以免 PMSF在水溶液中很快失效。3. 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或 4℃預(yù)冷，全部操作時間盡量控制在 1h 以內(nèi)。4. 通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取 1000g 和 12000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。有效期：一年有效。