細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)

產(chǎn)品貨號(hào)：R23340

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，最終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程，自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、病毒和細(xì)菌等。自噬是一種進(jìn)化上保守的降解過(guò)程，可靶向長(zhǎng)壽命蛋白、細(xì)胞器及其他細(xì)胞質(zhì)組分并通過(guò)溶酶體途徑進(jìn)行降解。自噬通路的激活對(duì)多種細(xì)胞功能都是必需的，包括饑餓狀態(tài)下的存活、細(xì)胞內(nèi)組分清除、發(fā)育及免疫等過(guò)程。

單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被用于檢測(cè)自噬體形成的特異性標(biāo)記染色劑，其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。尚寶細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，又稱為MDC染色液，可與EB合用雙染。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 低速離心機(jī)

2. 1.5ml離心管

3. 載玻片、蓋玻片

4. 熒光顯微鏡

操作步驟（僅供參考）：

(一)玻片法

1. 收集細(xì)胞，用300～500μ l的Wash buffer清洗細(xì)胞1次，800～1000g離心5min，棄上清。

2. 加入適量的Stain buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至10 ⁶ /ml。

3. 取5μ l MDC Stain(500×)加至245μ l Stain buffer，混勻，即為MDC Stain(10×)。

4. 取90μ l細(xì)胞懸液至新的1.5ml離心管中,加入10μ l的MDC Stain(10×)，輕輕混勻。

5. 37℃或室溫避光染色15～45min。

6. 800～1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用300～500μ l的Wash buffer清洗細(xì)胞2次，800～1000g離心5min，棄上清。

7. 加入100μ l的Wash buffer重懸細(xì)胞，滴加于載玻片上并加蓋玻片。

8. 熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。

(二)96孔板法

1. 配制MDC染色工作液：按MDC Stain(500×)：Stain buffer=1：499的比例混合，即為MDC染色工作液。如不能及時(shí)用完，應(yīng)-20℃避光保存。

2. 輕輕吸除96孔板中的培養(yǎng)液，加入100μ l MDC染色工作液至各孔，37℃ 5%CO₂避光孵育15～60min。

3. 各孔加入100μ l Wash buffer清洗2～3次。

4. 熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。

(三)MDC與EB雙染法

1. 收集細(xì)胞，用300～500μ l的Wash buffer清洗細(xì)胞1次，800～1000g離心5min，棄上清。

2. 加入適量的Stain buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 10 ⁶ /ml。

3. 取5μ l MDC Stain(500×)加至245μ l Stain buffer，混勻，即為MDC Stain(10×)。

4. 取90μ l細(xì)胞懸液至新的1.5ml離心管中，加入10μ l的MDC Stain(10×)和0.2uM EB染色液，輕輕混勻。

5. 滴加于在玻片上，室溫避光染色15～30min，加蓋玻片。

6. 熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。

染色結(jié)果：

正常細(xì)胞       細(xì)胞被均勻染成黃綠色熒光

凋亡細(xì)胞       染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，被染成大小不一，致密濃染的綠色顆粒。

注意事項(xiàng)：

1. MDC Stain和EB對(duì)人體有一定害處，請(qǐng)小心操作。

2. AO常與EB染色合用，可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。

3. 操作過(guò)程中應(yīng)注意減少試劑暴露于強(qiáng)光下的時(shí)間。

有效期：12個(gè)月有效。