谷胱甘肽S-轉移酶（GST）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。

產(chǎn)品貨號：BA1119

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品說明：

谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）是一種具有多種生理功能的蛋白質家族，主要存在于細 胞質內。GST是體內解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學物質及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價結合， 使親電化合物變?yōu)橛H水物質，易于從膽汁或尿液中排泄，達到將體內各種潛在或具備毒性的物質降解并排出體外 的目的。因此，GST在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學功能。此外，因為GST具有GSH-Px 活性，亦稱為non-Se GSH-Px，具有修復氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能。注意，GST催化的反應減少GSH含量，但是不增加GSSG含量。

GST催化GSH與CDNB結合，其結合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm；通過測定340nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

試劑三：臨用前加5mL蒸餾水溶解。

需自備的儀器和用品：

紫外-可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節(jié)移液器、研缽/勻漿器、1mL石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

二、測定步驟

1.        分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到340nm，蒸餾水調零。

2.        試劑二放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫。

3.        空白管：取1mL石英比色皿，加入100μL試劑一，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s吸光度記A1，25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴5min后，快速取出測定吸光度記A2。

4.        測定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s吸光度記A3，25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴5min后，快速取出測定吸光度記A4。

三、GST計算公式：

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結合為一個酶活性單位。

GST（U/mg prot）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×10⁶×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結合為一個酶活性單位。

GST（U/g 質量）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結合為一個酶活單位。

GST（U/10⁴cell）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×10⁶×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結合為一個酶活單位。

GST（U/mL）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×10⁶×V反總÷V樣÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；V反總：反應體系總體積，1100μL=0.0011 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1mL；T：反應時間，5min；W：樣本質量，g；V樣總：試劑一體積，1mL；細胞數(shù)量：以10⁴為單位，萬。

注意事項：

1.        樣本處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力。

2.        細胞中GST活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GST的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

3.        若樣本測定吸光度大于1，建議對樣本用蒸餾水稀釋，計算時結果乘以稀釋倍數(shù)。

4.        測定反映的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃或者37℃（哺乳動物）。

實驗實例：

1.        取0.1g月季加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，稀釋50倍置冰上待測，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A4-A3=0.647-0.587=0.06，ΔA空白管=A2-A1=0.591-0.539=0.052，按樣本質量計算得： GST（U/g質量）=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W×50（稀釋倍數(shù)）=0.92U/g質量。

2.        取0.1g肝加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，稀釋500倍置冰上待測，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A4-A3=0.824-0.543=0.281，ΔA空白管=A2-A1=0.591-0.539=0.052，按樣本質量計算得：GST（U/g質量）=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W×500（稀釋倍數(shù)）=263.35U/g質量。