α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

產(chǎn)品貨號：BA1016

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入12mL雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存。

標準品：液體×1支，5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說明：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細胞識別和一些信號分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

α-GC 分解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-GC 活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每1000萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：稱取約0.2g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。

3、標準樣品的準備：取100μL標準液，加入到400μL 試劑三中，得到1μmol/mL標準液，十倍稀釋到100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋：50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL做標準液。

二、測定步驟和加樣表：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表

充分混勻，放入37℃準確水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻，8000g，4℃，離心5min，取上清液（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置2min后， 400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。

三、α-GC 活力計算：

1、標準曲線建立：根據(jù)標準管的濃度（y）和吸光度（x，各標準管減去濃度為0的標準管為標準管A），建立標準曲線。

2、根據(jù)標準曲線，將ΔA（x）帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

GC 活力(U/mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

GC 活力(U/g鮮重) = (y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=18.67×y÷W

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

GC 活力(U/10⁴ cell)=(y×V反總)÷(1000×V樣÷V樣總)÷T=0.0187×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應體系總體積，0.28mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；1000：細胞或細菌總數(shù)，1000萬；T：反應時間，0.5h。