1. 若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠(yuǎn)，沒(méi)有做保冷措施

為防止細(xì)胞在運(yùn)輸路上開(kāi)始融化（特別是夏季），凍存細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至水浴鍋。

2. 運(yùn)輸凍存管時(shí)手觸碰到細(xì)胞部分或放在了口袋里

請(qǐng)勿用手觸碰凍存管身，避免局部溫度升高導(dǎo)致細(xì)胞開(kāi)始融化。應(yīng)捏住管蓋或放在容器中運(yùn)輸

3. 采用錯(cuò)誤的方式融化細(xì)胞

不要用手捂化（搓熱也不行），手心溫度不夠高，細(xì)胞受熱不均勻且降溫速度太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4. 水浴時(shí)沒(méi)有嚴(yán)格控制時(shí)間，直接放水里靜置，沒(méi)有晃動(dòng)促進(jìn)融化

細(xì)胞復(fù)蘇需遵循“快融"原則，建議在2min內(nèi)將細(xì)胞充分融化，水浴時(shí)間越長(zhǎng)活率越低。比較好的方法是捏住管蓋，將管身浸沒(méi)水中快速搖晃，促進(jìn)細(xì)胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。

5. 水浴結(jié)束時(shí)管內(nèi)還有較大冰塊

如果沒(méi)融化完quan，還有比較大的冰塊，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一方面冰塊中的細(xì)胞緩慢升溫而死亡，另一方面冰塊導(dǎo)致已融化的細(xì)胞被低溫?fù)p傷。

有的同學(xué)說(shuō)2min的水浴很難讓細(xì)胞融化，那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度（小編親測(cè)可行），搖晃速度加快，擔(dān)心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內(nèi)再進(jìn)行水浴。水浴鍋里的水不能太少，否則凍存管放入水后局部溫度會(huì)達(dá)不到預(yù)設(shè)溫度，導(dǎo)致融化過(guò)慢。

6. 細(xì)胞融化后沒(méi)有離心去除DMSO

有的同學(xué)復(fù)蘇細(xì)胞會(huì)在細(xì)胞融化后加10倍培養(yǎng)基稀釋?zhuān)浑x心直接培養(yǎng)，等細(xì)胞貼壁后換液。雖然這對(duì)于好養(yǎng)的貼壁細(xì)胞是可行的，但不是長(zhǎng)遠(yuǎn)之計(jì)，也不適用于懸浮細(xì)胞。DMSO對(duì)細(xì)胞有一定毒性，有些細(xì)胞對(duì)DMSO比較敏感，如HL-60細(xì)胞等。如果你不清楚自己的細(xì)胞是否對(duì)DMSO敏感，那么還是離心去除上清最為保險(xiǎn)。

以上由小尚多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)，結(jié)合凍存篇，基本可以解決所有復(fù)蘇失敗的問(wèn)題。如果還有沒(méi)提及的知識(shí)點(diǎn)，歡迎同學(xué)們可以在評(píng)論區(qū)補(bǔ)充~