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AUTOMACS系統(tǒng)自動分選體系分選小鼠CD4+CD25+抑制性細胞
PriCells: AUTOMACS系統(tǒng)自動分選體系分選小鼠CD4+ CD25+抑制性細胞
由此方法得到的陰性細胞（CD4+ CD25-）可用作反應細胞或?qū)φ占毎?/div>
實驗材料：
1. 小鼠
2. HBSS洗滌緩沖液
3. MACS緩沖液
4. CD8a（Ly-2）磁珠
5. 結(jié)合緩沖液
6. biotin-抗CD25（7D4）
7. Streptavidin-PE
8. 抗PE磁珠
9. *RPMI培養(yǎng)基
10. 小鼠CD3+T細胞富集柱和1×純化柱緩沖液
11. 15ml離心管，無菌
12. autoMACS系統(tǒng)和分選柱
13. 30mm尼龍網(wǎng)或40mm預分離濾膜
實驗方法：
1. 用20只小鼠的淋巴結(jié)制備單細胞懸液并去除紅細胞。
2. 將細胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。
3. 將細胞懸液在4℃，200g離心10min。離心過程中，準備3支小鼠CD3+T細胞純化柱，按說明書的指導用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液，在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。
4. 用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細胞。將細胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預分離濾膜后，每支純化柱中加入2ml細胞。室溫孵育15min。
5. 用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細胞。用血細胞計數(shù)器計數(shù)后，將細胞懸液在4℃，200g離心10min。
6. 將沉淀按每108個細胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個細胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。
7. 4℃，200g離心10min。
8. 以MACS緩沖液混懸細胞，使細胞濃度達到108個細胞/ml。將細胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預分離濾膜。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇depletes程序（CD4+ T細胞將從陰性通道洗脫。
9. 回收細胞計數(shù)，在4℃，200g離心10min。
10. 用結(jié)合緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g離心10min。
11. 用結(jié)合緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
12. 4℃，200g離心10min.
13. 用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
14. 4℃，200g離心10min。
15. 用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇posseld程序（CD4+ CD25+細胞將從陽性通道洗脫，CD4+ CD25-細胞將從陰性通道洗脫。
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