PriCells: 動(dòng)物子宮頸部上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 動(dòng)物子宮頸部穿刺或切除所得組織

2. 3T3成纖維細(xì)胞

3. 0.25%胰蛋白酶/EDTA

4. KCM：DMEM中添加10%FBS、0.5ug/ml氫化可de松和1×10-10mol/L霍亂毒素

5. EGF：100ugEGF溶于1ml無(wú)菌的UPW中。按100ul分裝，在-20℃條件下儲(chǔ)存。用10ml的含有血清的培養(yǎng)液配制100ug/mlEGF工作液，按100ul分裝，在4℃儲(chǔ)存。使用時(shí)，用含有血清的培養(yǎng)液稀釋（1：100）成最終濃度（10ng/ml）

6. CT：將1.18ml無(wú)菌的UPW加入1mg CT，配制成10-5mol/L CT液，在4℃儲(chǔ)存。將100ul 10-5mol/L CT加入10ml含血清培養(yǎng)液中，制成工作液。過(guò)濾除菌后，在4℃儲(chǔ)存。使用時(shí)，最終濃度為10-10mol/L

7. 氫化可de松：將1mg氫化可de松溶解于1ml 50%乙醇（v/v，用蒸餾水配制）。然后，按100ul分裝，在-20℃儲(chǔ)存。最終濃度為0.5ug/ml

8. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

9. 解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

10. 培養(yǎng)皿（直徑60mm和90mm）

11. 離心管（15ml、50ml）

12. 照射源：X射線或60Co

實(shí)驗(yàn)方法：

1. Swiss 3T3 成纖維細(xì)胞的準(zhǔn)備

（1） 準(zhǔn)備大量的3T3細(xì)胞，按1.5×104個(gè)/cm2的細(xì)胞密度將3T3細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)。24h后換液，每2-3d換液1次，4-5d傳代。使用的細(xì)胞不超過(guò)20代。

（2） 為了避免輕度污染，將一瓶生長(zhǎng)較好的細(xì)胞用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)。然后，在每代用這些細(xì)胞接種于該周所需要飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。

（3） 通過(guò)60Gy X射線或60Co照射使飼養(yǎng)細(xì)胞滅活。被照射的3T3細(xì)胞在4℃條件下可存放3-4d。

（4） 在無(wú)照射源的條件下，用絲裂菌素C滅活飼養(yǎng)細(xì)胞。在37℃條件下，用400ug/ml絲裂菌素C處理單層3T3細(xì)胞1h。用胰蛋白酶消化絲裂菌素C處理過(guò)的細(xì)胞，混懸細(xì)胞，用含有血清的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次。然后，用*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度。

2. 從轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)液中取出子宮頸部皮膚組織塊，用5ml含有50ug/ml硫酸慶大霉素和5ug/ml兩性霉素的無(wú)菌PBSA沖洗2-3次。將組織塊放入培養(yǎng)皿，表皮面朝下，用一次性手術(shù)刀剝除肌肉和真皮，保留薄而不透明的表皮片，用眼科剪將表皮片剪碎至1cm3大小。

3. 將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)入無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入15ml預(yù)先在37℃條件下預(yù)熱的胰蛋白酶-EDTA液，將三角瓶移入恒溫水浴振蕩器內(nèi)，37℃水浴中振蕩消化45min。在室溫條件下，將細(xì)胞懸液放置2-3min。取出細(xì)胞懸液，用不銹鋼或塑料濾網(wǎng)濾入50ml離心管。然后加入10ml*培養(yǎng)液。

4. 加入15ml預(yù)熱的胰蛋白酶-EDTA液含有表皮小塊的器皿，重復(fù)消化、過(guò)濾操作步驟2-3次。收集細(xì)胞懸液，以1000r/min，離心5min，吸去上清液，加入10ml*培養(yǎng)液，充分混懸細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后用臺(tái)盼藍(lán)拒染法估計(jì)細(xì)胞活力。

5. 用KCM稀釋細(xì)胞懸液，將2×104個(gè)/cm2表皮細(xì)胞與1×105個(gè)/cm2致命滅活的3T3細(xì)胞同時(shí)放入培養(yǎng)皿。60mm培養(yǎng)皿，接種1×105個(gè)/cm2個(gè)表皮細(xì)胞和5×105個(gè)/cm2個(gè)被照射的3T3細(xì)胞。

6. 在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)72h后，用添加10ng/ml EGF的培養(yǎng)液換液。在顯微鏡下檢查細(xì)胞，確定加入足夠的飼養(yǎng)細(xì)胞。如有必要，再加入飼養(yǎng)細(xì)胞。每周換液2次。8-12d，在顯微鏡下可見(jiàn)到角質(zhì)形成細(xì)胞克隆。14-16d，肉眼下見(jiàn)到角質(zhì)形成細(xì)胞克隆，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行傳代。

7. PriCells-原代上皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

8. PriCells-原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑。

9. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒。

10. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒。