PriCells: 正常人表皮朗格漢斯細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 多來(lái)自外科手術(shù)的臨床病人或死亡時(shí)間不超過(guò)24h尸體的胸、腹部皮膚；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 培養(yǎng)用液：①RPMI1640*培養(yǎng)液，由RPMI1640培養(yǎng)基添加10%人AB血清、2mol/L谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素和1μg/ml消炎痛；②D-Hanks平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+和Mg2+，添加慶大霉素50μg/ml；③消化液：為胰蛋白酶溶液，終濃度為0.05%。貯存液濃度為0.25%，分裝，-20℃下保存；④臺(tái)盼藍(lán)染液：濃度為0.16%溶于PBS中，過(guò)濾除菌，分裝保存（-20℃）；⑤淋巴細(xì)胞分離液（密度為1.077g/cm3）：臨用時(shí)以雙蒸水稀釋，1.6ml的雙蒸水加3.4ml的淋巴細(xì)胞分離液；⑥人基因重組的GM-CSF：濃度為200U/ml；

4. 培養(yǎng)器具：包括金屬手術(shù)器械如外科手術(shù)刀、組織剪、彎剪及眼科直、彎鑷等。此外，還有皮片制備器械如軟木板、消毒紗布、分離針頭、培養(yǎng)皿、削皮片和刀片等。所有用品均消毒后備用；

表皮細(xì)胞懸液的制備：

1．用外科手術(shù)刀將皮下脂肪除去，并將皮膚切成一定大小的皮片（不超過(guò)100cm2）。浸入20ml的D-Hanks平衡鹽溶液中30min；

2．在軟木板上覆蓋消毒紗布，并用大頭針將皮片固定其上。注意將皮片繃緊十分有利于皮片的制備；

3．抹干皮膚上液體，用備皮刀片取皮片。皮片厚大約0.15mm左右，由表皮和乳頭層組成，可根據(jù)需要調(diào)節(jié)片皮的刀片角度以制備出合格的皮片；

4．將皮片的真皮層朝下放入預(yù)冷的胰蛋白酶溶液中，于37℃下作用1h，或在4℃下過(guò)夜；

5. 向上述被消化的皮片中加入10ml含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液，終止胰蛋白酶溶液的消化作用；

6. 取出一個(gè)皮片，用注射用針頭或眼科用剪子細(xì)將表皮與真皮剝離。如表皮與真皮較易分離，說(shuō)明胰蛋白酶作用時(shí)間長(zhǎng)短適宜

7. 將表皮移入另一培養(yǎng)皿，加入少許胎牛血清，用彎剪將皮片剪碎，并用吸管不斷吹打；

8. 用消毒紗布過(guò)濾懸液，去除殘余團(tuán)塊、碎片和角化層；

9. 以含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液離心洗滌過(guò)濾液（1000r/min,10min）；

朗格漢斯細(xì)胞的富集：

1. 首先將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至5×106個(gè)/cm2；

2. 以2:1的比例在15ml離心管中分別加入細(xì)胞懸液與淋巴細(xì)胞分離液，以1500r/min離心20min；

3. 收集分界面上低密度組分，加入另一15ml離心管中。再用含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液離心洗滌2次（各1000r/min，5min）；

4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在相差顯微鏡下估計(jì)朗格漢斯細(xì)胞的數(shù)量百分比。朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量百分比低，可重復(fù)上述步驟，對(duì)朗格漢斯細(xì)胞進(jìn)一步富集；

朗格漢斯細(xì)胞的短期培養(yǎng)：

1． 將經(jīng)過(guò)上述富集過(guò)程的朗格漢斯細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度或部分富集表皮細(xì)胞以106個(gè)/ml密度種植，加入ROMI1640培養(yǎng)液（添加GM-CSF 200U/ml）；

2． 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集未貼壁細(xì)胞，貼壁基本上全部為朗格漢斯細(xì)胞；

3． 可重復(fù)上述朗格漢斯細(xì)胞富集過(guò)程，以去除死細(xì)胞和殘余的角質(zhì)形成細(xì)胞；

4． 繼續(xù)培養(yǎng)48—72h；

5． PriCells-原代表皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

6． PriCells-原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

7． PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒；

8． PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒；