PriCells: 正常兔原代晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)方案

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 正常兔晶狀體組織；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 注射器；

4. 培養(yǎng)器具：培養(yǎng)瓶或皿（用多聚賴氨酸包被）、眼科剪、鑷子等；

培養(yǎng)方法：

1. 空氣注射處死大兔，在無菌條件下清除鞏膜外肌肉及結(jié)締組織后將眼球浸入含雙抗的1×PBS（pH7.2）浸泡5min，移入超凈工作臺內(nèi)；

2. 用含雙抗的1×PBS（pH7.2）沖洗組織3遍，在超凈臺中環(huán)形剪除角膜放射狀剪開并撕除虹膜，充分暴露晶狀體赤道部，用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶體前囊膜，將前囊膜剪成1×1mm2大小的碎片；

3. 取200μl的吸頭一只，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5cm左右；

4. 組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶內(nèi)加入2ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶倒置在培養(yǎng)箱中，干貼壁2-4h；

5. 干貼壁完成后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)；48h后換液，更換2-3ml即可；

6. 貼塊貼壁培養(yǎng)4-7d后，在鏡下觀察可見大量細(xì)胞爬出，用吸管將組織塊吹下、去除，繼續(xù)放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中；

7. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

8. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

9. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒；

10. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒；

注意事項(xiàng)：

1. 材料預(yù)處理時要注意小心，不要破壞晶狀體結(jié)構(gòu)，要注意晶狀體前后，確保撕取的是前囊膜。

2. 將組織塊貼于培養(yǎng)瓶中后，對于培養(yǎng)瓶的移動，翻轉(zhuǎn)，加液等動作一定要輕柔，以免使組織塊浮起。

3. 去除組織塊的時機(jī)要選擇好，去除過早，細(xì)胞數(shù)量太少，會使細(xì)胞生長速度變慢，去除時間太晚，會使部分區(qū)域細(xì)胞生長過密，導(dǎo)致細(xì)胞老化，影響細(xì)胞狀態(tài)。

4. 嚴(yán)格控制上皮細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。

5. 關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被。

6. 傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時間為48小時。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為3-5代，5代后晶體上皮細(xì)胞明顯成纖維細(xì)胞化，呈梭形或條狀，細(xì)胞大小不等，細(xì)胞相互分離形成拉網(wǎng)現(xiàn)象，傳代消化時間會有所延長。