正常兔骨髓間充質(zhì)前體細胞的體外成軟骨培養(yǎng)

實驗材料：

1. 實驗動物：5月齡兔；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3. *培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液，補充10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；

4. 化學限定性培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加胰島素6.25μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25μg/ml、ya硒酸6.25μg/ml、亞油酸5.35μg/ml、牛血清白蛋白1.25μg/ml、丙酮酸鹽1mmol/L、抗壞血酸-2-磷酸鹽37.5μg/ml、地塞米松10-7mol/L、TGF-β110ng/ml。另加青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；

5. 離心管：15ml聚丙烯圓錐形離心管；

實驗方法：

1. 在注射器中預先吸入3000U肝素，然后從兔髂骨嵴或脛骨抽吸7—8ml骨髓；

2. 將*培養(yǎng)液加入取得的骨髓中，吹打分散細胞。計數(shù)有核細胞；

3. 在直徑為10mm的培養(yǎng)皿中接種2×107個有核細胞。于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)物用*培養(yǎng)液維持生長14d。每隔4d換液1次；

4. 培養(yǎng)至14d，用胰蛋白酶消化培養(yǎng)物，分散細胞。用*培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，收集細胞。計數(shù)；

5. 以每份5×105個細胞加到15ml聚丙烯圓錐形離心管中。離心（500g，10min）。棄上清液。注意不要分散細胞團塊；

6. 往離心管中小心加入化學限定性培養(yǎng)液，保持細胞團塊結(jié)構(gòu)。直接將離心管放到37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。間隔2—3d換液；

PriCells提供：

1. 各種原代細胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

2. 各種原代細胞培養(yǎng)特制添加劑；

3. 原代細胞分離試劑盒；

4. 原代細胞鑒定試劑盒；

5. 原代細胞總蛋白質(zhì)抽提物；

6. 原代細胞總RNA；

7. 原代細胞總DNA；