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PriCells: 藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法﹠PE-標(biāo)記蛋白A方法

時(shí)間:2021-10-19 閱讀:344
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PriCells: 藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法﹠PE-標(biāo)記蛋白A方法
        
藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法:
1.      巰基化藻紅蛋白(PE)的制備;
(1)         將600μl濃度為15.5mg/ml的鹽酸巰醇亞胺加到1.2ml濃度為3.6mg/ml的PE中;
(2)         將以上混合液和1.2ml pH6.8的PB混合,而后裝入透析袋置入50mmol/L pH6.8的PB中于4℃透析,過夜;
(3)         再換用pH7.5 PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結(jié)合8個(gè)巰基;
2.      巰基PE-IgG的制備;
(1)         將30μl濃度為1.1mg/ml的異雙功能試劑SPDP的乙醇溶液,加入到700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液(50 mmol/L pH7.5),在室溫中反應(yīng)2.5h;
(2)         再將400μl濃度為1.7mg/ml的巰基化PE加到500μl反應(yīng)混合液中,室溫反應(yīng)12h;
(3)         加入50 mmol/L的碘乙酸鈉100μl來封閉殘余巰基,于4℃下用PB透析過夜;
(4)         最后加入0.01%的Na3N3后分裝,于4℃保存半年;
 
PE-標(biāo)記蛋白A方法:
1.      稱取4.08mg PE溶于1ml濃度為0.1mmol/ml pH7.4的PBS中,溶解后,取出0.5ml,再加入濃度為2.65mg/ml的SPDP無(wú)水甲醇液10μl,SPDP/蛋白質(zhì)物質(zhì)的量比為10,22℃反應(yīng)5min,過Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/L pH7.4的PBS平衡和洗脫;
2.      將0.5ml濃度為2mg/ml的蛋白質(zhì)和100mmol/L pH7.4的PBS液混合,把2.6μl上述SPDP甲醇液加入混合液中,使得SPDP:蛋白質(zhì)=9:5,于22℃下放置40min后,再加如25μl pH7.4的二硫蘇糖醇(DTT)緩沖液,于22℃下反應(yīng)25min后,過Sephadex G-50,收集蛋白A峰;
3.      將0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合,于22℃下反應(yīng)6h后,將混合物于4℃保存?zhèn)溆茫?/span>
4.      將以上兩種PE標(biāo)記制品溶于0.01mol/L pH7.4 PB(含有0.1mol/L DETA、1mol/L 碘乙酰胺、1%BSA和0.1% NaN3)中,于0—4℃保存;


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