PriCells: 從人關(guān)節(jié)軟骨中分離軟骨祖細(xì)胞                

試劑和材料：

1.  骨關(guān)節(jié)炎患者行膝蓋關(guān)節(jié)半切開手術(shù)時(shí)未累及的部分；
   2. 鏈霉蛋白酶消化培養(yǎng)基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗壞血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、慶大霉素（50mg/ml），0.2%（終濃度100μg/ml）、鏈霉蛋白酶 70U/ml、HEPES 10mmol/L；
   3. 膠原酶消化培養(yǎng)基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗壞血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、慶大霉素（50mg/ml），0.2%（終濃度100μg/ml）、Ⅰ型膠原酶 300U/ml、HEPES 10mmol/L；
   4. 胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）PBSA配制；
   5. PBSC：含1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液；
   6. PBSA：無Ca²⁺,Mg²⁺的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液；
   7. 胎牛血清；
   8. 牛血清白蛋白（BSA），10μg/ml和1mg/ml，PBSC配制；
   9. 血清纖連蛋白，10μg/ml，PBSC配制；
   10. 尼龍膜，40μm篩網(wǎng)；
   11. 普通器皿，30ml，或離心管50ml，帶圓錐底部便于細(xì)胞離心；
   12. 解剖刀片，10號(hào)；
   13. 解剖刀柄，3號(hào)；
   14. 鑷子，2對(duì)（1大1小）；
   15. 礦油凝膠（凡士林）；
   16. 克隆杯，6mm；
   17. 分離軟骨用的鎖子甲手套；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 組織收集和細(xì)胞分離；
（1） 無菌條件下，用10號(hào)解剖刀片小心從軟骨下骨下面解剖軟骨。將軟骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培養(yǎng)皿中；
（2） 用鑷子和刀片仔細(xì)將軟骨切成1mm³小塊；
（3） 將軟骨小塊轉(zhuǎn)移至含18ml鏈酶蛋白消化培養(yǎng)基的普通器皿或離心管中；
（4） 置于滾轉(zhuǎn)機(jī)37℃處理1h；
（5） 吸出消化液棄之；
（6） 加入18ml膠原酶消化培養(yǎng)基，再次置于滾轉(zhuǎn)機(jī)37℃處理1h；
（7） 40μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾；
（8） 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
（9） 加入黏附測(cè)定培養(yǎng)基，620g離心10min進(jìn)行洗滌，用黏附培養(yǎng)基以2000個(gè)細(xì)胞/ml密度重懸細(xì)胞（4000個(gè)細(xì)胞）；

2. 差異黏附測(cè)定；
（1） 用10μg/ml纖連蛋白包被3.5cm Petri培養(yǎng)皿，4℃過夜。陰性對(duì)照使用10μg/ml BSA；
（2） 吸出液體，用含1mg/ml BSA的PBSC封閉培養(yǎng)皿30min；
（3） 加入2ml培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液靜置20min；
（4） 吸出培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，置于第二個(gè)培養(yǎng)皿中20min；
（5） 向第一個(gè)培養(yǎng)皿中加入2ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基后置于孵箱；
（6） 從第二個(gè)培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞至第三個(gè)培養(yǎng)皿中；
（7） 向第二個(gè)培養(yǎng)皿中加入2ml生長(zhǎng)配演技后置于孵箱；
（8） 向最后一個(gè)培養(yǎng)皿中加入200μl FBS后置于孵箱；
（9） 3h后，用相差顯微鏡計(jì)數(shù)最初貼壁的細(xì)胞；
（10） 培養(yǎng)細(xì)胞，至明顯可見多于32個(gè)細(xì)胞的集落，一般需要10天；

3. 集落擴(kuò)增；
（1） 用相差顯微鏡鑒定多于32個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落，在培養(yǎng)皿下用記號(hào)筆將其畫圈標(biāo)記；
（2） 計(jì)數(shù)和記錄每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)量；
（3） 從Petri培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，用PBSA潤洗；
（4） 在克隆環(huán)上無菌涂抹凡士林，或者使用無菌鑷子直接將其浸入凡士林；
（5） 將克隆環(huán)置于集落上，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液，靜置5—10min——相差顯微鏡觀察細(xì)胞已脫落；
（6） 重懸細(xì)胞，置于Eppendorf管中，300g離心5min；
（7） 生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌，重復(fù)上述離心；
（8） 生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋，12孔板中每孔接種1個(gè)集落；
（9） 細(xì)胞匯合時(shí)，接種至3.5cm培養(yǎng)皿（或6孔板），然后再移至較大培養(yǎng)瓶；