PriCells: 收集大鼠骨髓用于生產(chǎn)MSCs

試劑和材料：
1. *培養(yǎng)基（CCM）：α-MEM：α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無(wú)核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存于4℃，不超過(guò)2周；
2. 紗布；
3. 含100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和0.2μg/ml兩性霉素B的PBSA；
4. 無(wú)鎂和鈣的Hank′s平衡鹽溶液（HBSS）；
5. 塑料Petri培養(yǎng)皿，15cm直徑；
6. 裝有#10和#15刀片的解剖刀；
7. 1和2英尺刀刃的手術(shù)剪；
8. 鑷子；
9. 止血鉗；
10. 15cm刀刃的咬骨鉗；
11. 帶Luer接頭的注射器，20ml；
12. 皮下注射針，23號(hào)和18號(hào)；
13. 微量離心管，1.5ml和0.5ml；
14. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
15. 成年Lewis大鼠；
16. CO_²嚙齒動(dòng)物安le死小室；
17. Eppendorf 5417C微量離心器或同等設(shè)備；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. CO2窒息處死動(dòng)物，切勿使用藥物；
2. 用酒精擦拭后肢，在不破壞股骨的情況下解剖后肢。將股骨從肢體中分離出來(lái)；
3. 切除股骨上的肌肉和肌腱。用無(wú)菌紗布擦拭除去骨上的剩余組織；
4. 用酒精擦拭已清理干凈的骨，將其放入50ml塑料管中；
5. 用含抗真菌藥物的冰浴CCM浸沒(méi)骨，直到骨髓提取準(zhǔn)備完畢。從分離骨到骨髓提取的時(shí)間盡量縮短；
6. 裝有股骨的離心管移至微生物安全櫥中，將骨放入15cm petri培養(yǎng)皿中；
7. 按如下步驟提取骨髓；
（1） 用咬骨鉗剪掉骨的兩端，暴露內(nèi)部骨髓；
（2） 裝有23G針頭的注射器中吸入5ml含抗真菌藥物的CCM，向50ml離心管中沖洗每根股骨；
（3） 吸取沖洗后的CCM，反復(fù)沖洗股骨3次，將其轉(zhuǎn)移至15ml離心管中；
（4） 1000g離心，用1ml含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓沉淀；
（5） 在15ml離心管中將1ml骨髓細(xì)胞懸液加入到4ml含抗生素和抗真菌藥物的新鮮PBSA中。每根股骨所得的5ml細(xì)胞懸液可混合于同一個(gè)離心管中；
8. 在10℃ 1000g離心骨髓細(xì)胞10min，用10ml含抗生素和抗真菌藥物的PBSA洗滌細(xì)胞3次；
9. 最后，用5ml CMM重懸骨髓細(xì)胞，置于冰上備用；