這個病原體這段時間怎么經(jīng)常檢出？不會是有污染了吧？
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在您看到熒光定量PCR結(jié)果的時候是否也有過這樣的疑問？隱隱約約感覺實驗?zāi)硞€步驟出現(xiàn)問題，卻又不知該從何下手。別擔(dān)心，有“對照精靈”們來助您一臂之力。
熒光定量PCR實驗，從樣本采集到結(jié)果分析包含多個實驗步驟，針對不同的步驟，可以選擇不同的對照對流程進行監(jiān)控（圖1）。
圖1. 實驗流程和常見陰陽性對照種類。
熒光定量PCR的靈敏度可以達到1拷貝/孔，如此高靈敏度的檢測手段對實驗過程中的污染也非常敏感，我們也無法從單一孔中的擴增曲線來判斷是否來源于污染還是來源于真實樣本的擴增。這時，就需要陰性對照來監(jiān)控和發(fā)現(xiàn)污染的發(fā)生。常用的陰性對照包括以下幾種：
使用水代替定量PCR反應(yīng)中的核酸，其它試劑照常加入，用于監(jiān)控擴增反應(yīng)體系中的污染。正常情況下，NTC孔不會有擴增；當(dāng)NTC出現(xiàn)擴增，則預(yù)示體系中有污染。在SYBR Green實驗中，NTC出現(xiàn)擴增也可能是來源于引物二聚體的形成，此時則需要通過優(yōu)化引物的設(shè)計來減少引物二聚體對結(jié)果的影響。
No Reverse-Transcriptase Control, No RT
當(dāng)進行RNA定量實驗時，如果引物和探針設(shè)計在同一個外顯子上，就無法從結(jié)果中判斷擴增是否來源于未去除干凈的DNA，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。除了在引物和探針設(shè)計上面下功夫，還可以設(shè)置無逆轉(zhuǎn)錄酶對照。即在逆轉(zhuǎn)錄實驗時，不加逆轉(zhuǎn)錄酶，并進行后續(xù)的定量PCR檢測。無逆轉(zhuǎn)錄對照中由于沒有cDNA，DNA聚合酶無法擴增mRNA，則不應(yīng)發(fā)生擴增。如果檢測到擴增，則樣本中可能含有未去除干凈的DNA。陰性樣本指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。從核酸提取開始做起，經(jīng)歷提取、逆轉(zhuǎn)錄（如有）和擴增過程。如果出現(xiàn)擴增，則說明其中某一實驗步驟中存在污染，結(jié)合NTC結(jié)果，可以判斷是否是樣本提取過程中引入的污染。
熒光定量PCR實驗從樣本采集到最后的結(jié)果分析分為幾個步驟完成，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。當(dāng)出現(xiàn)一個無擴增或者Ct值偏大的樣本孔，到底是真的沒有要檢測的對象，還是擴增有問題，亦或是提取中的問題？為了發(fā)現(xiàn)這種假陰性的發(fā)生，合理的陽性對照可以監(jiān)控實驗的不同步驟：
可使用含有擴增片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴增陽性對照，監(jiān)控?zé)晒舛縋CR的體系是否正常，包括酶、引物、探針等。如果檢測中包含多個目標(biāo)片段，可以將這些目標(biāo)片段都克隆到同一個質(zhì)粒中，方便制備和使用。當(dāng)擴增對照沒有擴增，或者Ct值大于預(yù)期，則說明定量PCR體系存在問題。
Internal Positive Control, IPC
如果想監(jiān)控每一份樣本從核酸提取到逆轉(zhuǎn)錄以及最后的熒光定量PCR的過程，可以在提取之前在每個樣本中加入一段外源DNA或RNA（不含目的片段）（表1），并在定量PCR時進行單管多重PCR，同時檢測目的基因和這段序列。在每個樣本中加入特定拷貝數(shù)的IPC，進而從該段序列的Ct值判斷對應(yīng)樣品孔中的核酸富集和擴增效率。也可以選擇的逆轉(zhuǎn)錄或者擴增的時候加入到每一個樣本孔中，單獨監(jiān)測純化后的核酸中是否含有逆轉(zhuǎn)錄/擴增抑制劑（圖2）。
表1：陽性內(nèi)對照和相關(guān)試劑盒
圖2：通過IPC提示體系中抑制劑的存在。實驗結(jié)果為同樣濃度的RNA加入相同拷貝Xeno IPC，在不同濃度的擴增抑制劑血紅素存在下（0-4μM），Xeno IPC的Ct值與目標(biāo)RNA的Ct值定量結(jié)果。
陽性內(nèi)對照雖然可以在一定程度上反應(yīng)核酸提取效率，但是卻很難反饋提取流程中對核酸釋放的效率。一些病原體的樣本，尤其是含有革蘭氏陽性菌或者真菌樣本，充分的酶消化或者機械裂解對于最終檢測的靈敏度有顯著影響。為了能更好的反映提取效率，可以選擇已知陽性的樣本或者保存在相似基質(zhì)中已知濃度的病原體，作為單獨的樣本進行提取和后續(xù)的RT-PCR，通過Ct值評斷實驗流程。上面提到的陽性對照能夠為實驗流程提供很多質(zhì)控信息。對于樣本本身的質(zhì)量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運輸和保存過程中是否有嚴重的降解等問題，則可以通過對內(nèi)參基因的定量來幫助回答。
內(nèi)參基因一般選擇在取樣組織或細胞中均有足量表達的基因，且其表達量不受環(huán)境、實驗處理條件和取樣時間等因素影響， 如管家基因（housekeeping gene）。常用人類內(nèi)參基因如表2所示。要注意沒有某個內(nèi)參基因是萬能的，需要根據(jù)樣本類型和實驗處理方式進行評估和選擇（可參考Application Note: Using TaqMan Endogenous Control Assays to select an endogenous control）。實驗中通過內(nèi)參基因的Ct值來判斷取樣和樣本降解情況。在相對定量實驗中，內(nèi)參基因亦可用于對取樣量進行均一化。
如果進行的是單管多重實驗，還需考慮內(nèi)參基因的表達量。當(dāng)內(nèi)參基因表達量遠高于目的基因時，內(nèi)參基因?qū)?yōu)勢擴增，體系中的原料消耗速度過快，造成目的基因擴增效率降低。此時可以選擇引物濃度降低的TaqMan試劑盒（Primer-Limited）對內(nèi)參基因進行測定。
表2：常用人類內(nèi)參基因試劑盒（cDNA）
如何避免污染發(fā)生？出現(xiàn)污染怎么辦？
為了避免樣本之間的交叉污染，規(guī)范化的取樣和樣本保存非常重要。不同樣本移液時謹記更換槍頭，并盡量使用帶濾芯的槍頭；不同樣本盡量避免同時開蓋或劇烈震蕩樣本，也要避免反復(fù)吹吸導(dǎo)至的氣溶膠形成和擴散。一旦發(fā)生樣本溢出，應(yīng)馬上進行清污，降低對后續(xù)實驗造成的影響。
對于核酸提取儀、實驗臺面、超凈臺等可在實驗結(jié)束后用70%的乙醇或者10%的次氯酸鈉（具腐蝕性，建議使用前咨詢設(shè)備供應(yīng)商）擦拭或者利用紫外線照射5-20分鐘進行表面清潔。如果需要對殘留的核酸進行更*的清潔， DNAZap™ PCR DNA Degradation Solutions能更有針對性地降解儀器和臺面上殘留的DNA和RNA。
按照標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室的分區(qū)要求，在清潔度最高的“試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)”進行試劑的制備、分裝和預(yù)混液的制備。大包裝的qPCR試劑開封后進行分裝，以減少反復(fù)凍融和吸取次數(shù)。在做多樣本PCR反應(yīng)時，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸。避免同時開蓋，實現(xiàn)*閉管操作。實驗試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實驗室分區(qū)通過“標(biāo)本制備區(qū)”和“擴增區(qū)”分割開PCR體系配置和PCR擴增實驗。如果不具備這樣的條件，首先要避免熒光定量PCR實驗結(jié)束之后開蓋，以防擴增產(chǎn)物形成氣溶膠對后續(xù)實驗造成污染。少量意外開蓋不能避免時，可以使用含有UNG酶（uracil-N-glycoslyase, 尿嘧啶DNA糖基化酶）的擴增預(yù)混液。如果在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP參入到PCR產(chǎn)物中，形成了含有dUTP的擴增產(chǎn)物，UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈 DNA 中 U 堿基的糖苷鍵， 降解 PCR 擴增產(chǎn)物，對于熱敏感性的UNG酶，50℃溫度即可失活，不影響本次擴增片段。
通過以上介紹，相信大家已經(jīng)對不同的對照種類和用途有了足夠的了解，在實踐中還需要針對具體需求進行選擇。合理的對照能讓我們及時發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR實驗中的問題，而規(guī)范的操作流程和良好的實驗習(xí)慣才能在根源上避免這些問題的發(fā)生。雙劍合并才能放心地收獲實驗結(jié)果。
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