搞定內(nèi)參，駕馭 Western blot 已成功一半

western blot 對(duì)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)新人而言，絕對(duì)是心中痛，一碰就要抓狂。沒(méi)辦法,誰(shuí)讓導(dǎo)師發(fā)話了，WB 做不好，延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道，WB 想說(shuō)愛(ài)你不容易。那么為了*馴服 WB，獲得漂亮且理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一個(gè)良好的參照體系就絕對(duì)是*的存在。 

一般而言，良好的參照體系包括： 

*體重計(jì)（分子量 marker）：可確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小 

*光桿司令（空白對(duì)照）：不加一抗和二抗，用于檢測(cè)膜的性質(zhì)的封閉效果 

*好榜樣（陽(yáng)性對(duì)照）：已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照，可檢測(cè)抗體的工作效率

*打醬油的（陰性對(duì)照）：不表達(dá)靶蛋白的組織或樣品，檢測(cè)抗體的特異性 

*單飛者（二抗對(duì)照）：不加一抗，檢測(cè)二抗的特異性。 

*校正者（內(nèi)參對(duì)照）：檢測(cè)標(biāo)本系統(tǒng)和抗體系統(tǒng)，減少蛋白定量、上樣過(guò)程中的誤差

內(nèi)參君的初次登場(chǎng) 

在此，小編就帶領(lǐng)大家一起來(lái)認(rèn)識(shí)認(rèn)知這位“有名"的內(nèi)參君吧。內(nèi)參（Internal Control），簡(jiǎn)而言之，一般指的是由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），因其表達(dá)恒定被用于檢測(cè)蛋白表達(dá)水平變化時(shí)的參照物，可確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Tips: 

1）在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的內(nèi)參。 

2）內(nèi)參的選擇需要考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。 

eg：在細(xì)胞增殖相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun 由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin 等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。

鋒芒畢露的內(nèi)參君 

正所謂，養(yǎng)兵千日，用在一時(shí)?？墒呛芏鄬?shí)驗(yàn)菜鳥在選好內(nèi)參之后，對(duì)下一步如何發(fā)揮內(nèi)參君的本領(lǐng)感到一愁莫展。那么以下三個(gè)妙招可一解大家的燃眉之急。 

1、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入 HRP 標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。 

2 、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以*行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用膜再生液（P1650）洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。

3 、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì) Marker 的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi)。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。 如此下來(lái)，各位小伙伴就可以坐等鋒芒畢露的內(nèi)參君為我們擒獲漂亮且理想的內(nèi)參圖片。