怎么預(yù)防支原體——看米高梅科學(xué)家怎么說(shuō)（上）

這篇文章Kaustubh Kishor Jadhav撰寫的，今天先分享的是他的上一段，關(guān)于細(xì)胞支原體污染的原因和怎么檢測(cè)細(xì)胞支原體污染，他是米高梅生物科學(xué)與技術(shù)研究所的研究助理。

如果你正在閱讀這篇文章，如果你的實(shí)驗(yàn)室里有支原體，不要驚訝。因?yàn)樗鼈兇嬖谟诖蠖鄶?shù)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中，是每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)工作者必須解決的問(wèn)題。據(jù)估計(jì)，高達(dá)60%的細(xì)胞培養(yǎng)污染是支原體污染（Uphoff，2002年統(tǒng)計(jì)）。

支原體被認(rèn)為是最是簡(jiǎn)單、最小的細(xì)菌之一。缺乏堅(jiān)硬的細(xì)胞壁使它們對(duì)抗生素和抗菌藥物如青霉素和鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。支原體可以通過(guò)過(guò)濾器，因?yàn)樗軌蜃兂扇魏涡螤钜责じ皆诩?xì)胞壁上。

支原體污染的原因

支原體通過(guò)各種難以追蹤的來(lái)源進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)。這些包括實(shí)驗(yàn)室人員、血清、細(xì)胞培養(yǎng)基、水浴、培養(yǎng)箱等。人類支原體污染是上述污染的最大來(lái)源。污染物可以通過(guò)臟衣服、實(shí)驗(yàn)服、以及層流氣流附近的會(huì)語(yǔ)、頭皮屑、打噴嚏、咳嗽等傳播。此外，無(wú)論在哪里保存細(xì)胞培養(yǎng)物，持續(xù)不斷的個(gè)體流動(dòng)都會(huì)增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。

由于實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備落后以及節(jié)約成本等原因，支原體可以通過(guò)交叉污染從這些來(lái)源傳播，這包括對(duì)多個(gè)細(xì)胞系重復(fù)使用移液管，而不是使用一次性移液管或重復(fù)使用手套。血清也是支原體污染的來(lái)源。由于其渾濁的性質(zhì)，污染是很難檢測(cè)到的血清，這是較為常用的每種細(xì)胞培養(yǎng)。重復(fù)使用同一瓶血清可促進(jìn)支原體的生長(zhǎng)。血清營(yíng)養(yǎng)豐富，也是支原體增殖的最佳來(lái)源。另外，它是在高壓滅菌后添加到培養(yǎng)基中的，因此，不能保證血清無(wú)污染。

在層流氣流倉(cāng)中工作時(shí)（說(shuō)話或移液時(shí)）產(chǎn)生的氣溶膠也是造成污染的主要原因之一。在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，這些產(chǎn)生的氣溶膠將進(jìn)入培養(yǎng)基，如果細(xì)胞系暴露時(shí)間較長(zhǎng)，這些氣溶膠將從空氣中進(jìn)入細(xì)胞。這些氣溶膠肉眼看不見(jiàn)，因此在導(dǎo)致污染之前無(wú)法被檢測(cè)到。

問(wèn)題的另一個(gè)來(lái)源是用于傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它有液體和粉末兩種形式。由于處理不當(dāng)或?qū)嶒?yàn)室環(huán)境不好，支原體可以通過(guò)這種粉狀培養(yǎng)基傳播。過(guò)濾不能確保*滅菌，因?yàn)橹гw甚至可以逃逸0.2微米的過(guò)濾器。

支原體可以在干燥狀態(tài)下保持較長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)它們接觸到營(yíng)養(yǎng)源時(shí)，很快就會(huì)開(kāi)始增殖。一旦它們出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，就很難*。你可以抑制支原體的生長(zhǎng)，但不能**它。當(dāng)支原體出現(xiàn)在培養(yǎng)基中時(shí)，丟棄培養(yǎng)源是一個(gè)很好的選擇（除非培養(yǎng)源不可替代或價(jià)格昂貴）。

怎么檢測(cè)細(xì)胞支原體

用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測(cè)支原體是非常困難的，那么你怎么知道它在那里呢？您可以使用PCR的檢測(cè)、DNA染色、熒光標(biāo)記、瓊脂平板等。明智地選擇下面列出的任何一種技術(shù)，并始終使用第二次分析來(lái)確定。在檢測(cè)支原體之前，細(xì)胞應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)至少兩周，以便有時(shí)間讓低濃度的污染物生長(zhǎng)。對(duì)于試驗(yàn)，取樣前至少兩天或三天不應(yīng)更換培養(yǎng)基（Uphoff和Drexler，2011）。

軟瓊脂培養(yǎng)被認(rèn)為是檢測(cè)支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)"。在這種方法中，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液被加入液體或半固體培養(yǎng)基（含有支原體生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素）。受感染的細(xì)胞在含有培養(yǎng)基的瓊脂平板上都會(huì)生長(zhǎng)。支原體菌落在瓊脂平板上很容易看到。除少數(shù)支原體外，該方法能檢測(cè)大多數(shù)支原體。

另一種用于支原體檢測(cè)的方法是PCR。在這項(xiàng)技術(shù)中，針對(duì)各種常見(jiàn)感染支原體的16sRNA基因的PCR引物被使用。廣泛的引物包含幾乎所有可感染的支原體。過(guò)程中使用的引物要么是物種/基因特異性的，要么是通用的。該方法快速、高效、可靠且效益高（Sung，2006）。

顯色法檢測(cè)細(xì)胞支原體。一旦檢測(cè)到支原體，試劑就會(huì)引發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高，特異性低（Degeling，2012）。

生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒可從不同的生物技術(shù)公司獲得，這些公司是基于酶的支原體檢測(cè)試劑盒。這些試劑盒檢測(cè)的支原體酶不是由真核細(xì)胞合成。首先，試劑盒的成分使支原體破裂，然后使用特定的酶來(lái)觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)光的細(xì)胞機(jī)制，然后通過(guò)光度計(jì)檢測(cè)到。

感染培養(yǎng)基中可加入非特異性DNA染色劑檢測(cè)支原體。當(dāng)在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，支原體DNA除了細(xì)胞DNA外，還以小簇的形式出現(xiàn)。

熒光DNA染色是另一種DNA染色方法。這種方法使用像DAPI和hoechst33258這樣的DNA染色劑來(lái)染色所有的DNA。在這個(gè)過(guò)程中需要一些專業(yè)知識(shí)，因?yàn)榻Y(jié)果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細(xì)菌的污染或這些細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外熒光信號(hào)都會(huì)妨礙正確的結(jié)果解釋。此外，來(lái)自核區(qū)的信號(hào)使支原體的檢測(cè)變得困難（Ligasová，2019）。這種方法一般不建議使用。