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中級(jí)會(huì)員 | 第5年

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（五）

時(shí)間：2021/10/12閱讀：1365
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想要提高探針的的效果，可以考慮在探針上采用LNA（鎖核酸）堿基或MGB（小溝結(jié)合劑）基團(tuán)。


這樣做的效果是：

1、增強(qiáng)探針與靶序列的雜交強(qiáng)度。增強(qiáng)結(jié)合的特異性后，背景噪聲降低，從而提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度。


2、一般為滿足設(shè)計(jì)要求，AT序列豐富的探針需要長(zhǎng)達(dá)40個(gè)核苷酸。通過LNA堿基或MGB的取代，可以將長(zhǎng)度減少至13～20個(gè)核苷酸，而不影響效果。


為什么這樣的方法可以提高探針的效果？


LNA堿基是一種核苷酸類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以限制DNA構(gòu)象為理想的Waston-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)。每插入1個(gè)LNA堿基，可以使Tm值增加3～6°C。


MGB基團(tuán)是一個(gè)能結(jié)合到DNA小溝的三肽分子，能與互補(bǔ)的單鏈DNA高特異性、高強(qiáng)度地結(jié)合。


例如SNP基因分型實(shí)驗(yàn)，要求所有引物、探針復(fù)性溫度一致的多重PCR實(shí)驗(yàn)，就很適合使用這個(gè)方法。


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