化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的原理

將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化通常有兩種方法：化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電穿孔法。

電穿孔法的轉(zhuǎn)化率高達(dá) 10⁹ ～ 10¹⁰個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg 質(zhì)粒 DNA，轉(zhuǎn)化率比化學(xué)轉(zhuǎn)化法高，當(dāng)可能得到的每一個(gè)克隆都非常重要時(shí)（如構(gòu)建cDNA文庫(kù)），就需要用電穿孔法。

化學(xué)轉(zhuǎn)化法一般每微克 DNA 能獲得10⁵ ～ 10⁶個(gè)轉(zhuǎn)化子，可滿足常規(guī)的克隆實(shí)驗(yàn)需求，因此化學(xué)轉(zhuǎn)化法在克隆實(shí)驗(yàn)中是較為常用到的轉(zhuǎn)化方法。

化學(xué)轉(zhuǎn)化法中用到的感受態(tài)細(xì)胞是化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法來(lái)制備。

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)步驟可以簡(jiǎn)單分為以下4步：

1、冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，將DNA加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰上放置30 min

2、42 ℃熱激，冰上孵育2 min

3、加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇

4、離心后棄部分上清，重懸后涂板，過夜培養(yǎng)

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第一步，加入DNA后，輕彈管壁混勻，冰上靜置，使Ca2+與DNA結(jié)合中和DNA的負(fù)電荷，Ca2+與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合中和電荷，克服了外來(lái)DNA和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的負(fù)電荷排斥作用。Ca2+與DNA和細(xì)菌細(xì)胞膜脂多糖的磷酸鹽形成配位絡(luò)合物，Ca2+促進(jìn)了DNA和脂多糖的結(jié)合。

圖2.Ca2+克服了外來(lái)DNA和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的負(fù)電荷排斥

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第二步是熱激。熱激使溫度升高，細(xì)胞膜的脂質(zhì)釋放（圖3-A），在細(xì)胞膜上形成孔隙（圖4-E），DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。熱激后在冰上冷卻2 min，溫度降低，細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)釋放（圖3-B），脂質(zhì)占比增高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性升高，細(xì)胞膜上的孔隙消失（圖4-F）。

圖3. A：脂質(zhì)釋放曲線，B：蛋白質(zhì)釋放曲線

圖4.感受態(tài)細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中表面形態(tài)的變化

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第三步，加入LB培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇，該步驟的主要作用是使感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，使感受態(tài)細(xì)胞中的質(zhì)粒表達(dá)抗性基因，這樣在涂板后帶有目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌在相應(yīng)抗性的平板上才能正常生長(zhǎng)。