材料與儀器：
原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞，F(xiàn)ITC，TRITC
實驗步驟：
雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟
若在同一標(biāo)本中有兩A和B種抗原需要同時顯示，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用TRITC標(biāo)記，可采用以下染色方法：
免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙重染魚法
原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞：在骨發(fā)生形態(tài)蛋白―{誘導(dǎo)下，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet―1(呈紅色熒光)共存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)
1．一步雙染色法先將兩種熒光標(biāo){己抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接法進行染色。
2．二步雙染色法先用TRITC標(biāo)記的A抗體進行免疫熒光染色，再用FITC標(biāo)記的B抗體染色，根據(jù)兩種抗體的動物種屬不同，可用直接法也可用間接法，結(jié)果A抗原呈現(xiàn)橘紅色熒光，而B抗原呈現(xiàn)黃綠色熒光。在應(yīng)用中，常用的方法是免疫熒光組織化學(xué)中間接法和SABC-Cy3法相結(jié)合。例如，在實驗設(shè)計時，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，相匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。
進行雙重染色時，由于兩種一抗種屬來源不同，可把一抗混合使用。孵育結(jié)束后洗滌未結(jié)合的一抗，滴加二抗時，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗滌后，滴加SABC-Cy3復(fù)合物，經(jīng)熒光顯微鏡下觀察已出現(xiàn)特異性熒光，再進行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片觀察。其結(jié)果A抗原呈現(xiàn)綠色熒光，B抗原呈現(xiàn)紅色熒光。
此法應(yīng)注意兩種一抗在混合稀釋時，抗體的終濃度應(yīng)為每一種抗體的工作濃度。換言之，混合后的液體要同時滿足兩種一抗的工作濃度。若兩種一抗種屬來源相同，必須分兩次進行雙重染色，即先用第一種一抗和第一種熒光二抗對A抗原進行染色，洗滌后，用第二種一抗和第二種熒光二抗對B抗原進行染色，否則會出現(xiàn)交叉反應(yīng)而使染色無特異性。
