做好流式太難？可能方法就用錯(cuò)了，解決思路看這里!

現(xiàn)已被廣泛用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。典型的應(yīng)用實(shí)例包括血液系統(tǒng)疾病的免疫分型，腫瘤學(xué)中細(xì)胞 DNA 的倍體和周期分析，細(xì)胞生物學(xué)研究中的細(xì)胞凋亡、增殖，細(xì)胞表面或胞內(nèi)的抗原檢測(cè)等。

其中，流式技術(shù)較為廣泛的應(yīng)用是使用流式抗體進(jìn)行細(xì)胞的分型鑒定，常見(jiàn)的免疫表型分析實(shí)驗(yàn)包括單細(xì)胞懸液制備、細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗體的染色、上機(jī)檢測(cè)等基本步驟。

直接法：熒光標(biāo)記的抗體直接與細(xì)胞的抗原結(jié)合，一步孵育后即可以進(jìn)行細(xì)胞的流式上機(jī)檢測(cè)。直接法因?yàn)槠浞奖憧旖?，交叉反?yīng)和背景少，是目前主流的流式標(biāo)記手段。

間接法：細(xì)胞先與一抗進(jìn)行孵育，然后熒光二抗再結(jié)合到一抗上形成免疫檢測(cè)復(fù)合物，后續(xù)即可以進(jìn)行上機(jī)。當(dāng)商品化的直標(biāo)抗體無(wú)法獲得時(shí)，間接法可以作為補(bǔ)充，但間接法在多色實(shí)驗(yàn)中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)，選擇性會(huì)大大受到影響。

兩種流式細(xì)胞標(biāo)記法原理見(jiàn)圖 1。

圖 1 流式抗體標(biāo)記常見(jiàn)的兩種形式

（左圖為直接法，右圖為間接法）

除選擇上述兩種商品化標(biāo)記抗體外，還可使用抗體標(biāo)記試劑盒標(biāo)記抗體，獲取實(shí)驗(yàn)所需的熒光標(biāo)記抗體，但該方法對(duì)技術(shù)要求高，標(biāo)記效果往往受多種因素影響。常見(jiàn)的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法，見(jiàn)表 1。

表 1 常見(jiàn)的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法

隨著流式細(xì)胞儀、單克隆抗體和熒光探針的不斷發(fā)展，流式分析已經(jīng)從早期的單激光單色檢測(cè)，發(fā)展到可快速同時(shí)定量檢測(cè)一種細(xì)胞的多種特性，多色多參數(shù)多激光的檢測(cè)分析。

同時(shí)分析多個(gè)抗原或多種細(xì)胞特性的能力為越來(lái)越復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)打開(kāi)了新的大門(mén)，但多色流式細(xì)胞分析需要平衡多個(gè)難題的解法，包括儀器配置、抗原表達(dá)和染料亮度，以及可用的抗體- 染料組合等，考慮的要素見(jiàn)圖 2。

圖 2 流式多色方案設(shè)計(jì)需要考慮的要素

流式的配色需要綜合考慮以下因素：

如果研究人員無(wú)法在一次實(shí)驗(yàn)中妥善調(diào)和上述因素，就需要退而求其次，進(jìn)行多次分析。而多次分析難免引入各不相同的實(shí)驗(yàn)條件，由此造成的數(shù)據(jù)波動(dòng)最終會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不可靠。

ColorWheel^® 流式抗體和染料組合采用專為流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)化的專（禾刂）技術(shù)，支持用戶分別選擇抗體和染料并根據(jù)自身需要任意組合，在保證實(shí)驗(yàn)成功率的同時(shí)又可幫助簡(jiǎn)化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限。

主要優(yōu)勢(shì)：

ColorWheel^® 技術(shù)基于專（禾刂）的寡核苷酸配對(duì)連接技術(shù)將抗體與染料偶聯(lián)起來(lái)（詳見(jiàn)圖 3），偶聯(lián)產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的直標(biāo)抗體保持一致，可以直接用于流式的標(biāo)記檢測(cè)。該技術(shù)的偶聯(lián)過(guò)程只需要簡(jiǎn)單的 1:1 的混合，其偶聯(lián)過(guò)程比起傳統(tǒng)的抗體標(biāo)記方法大大簡(jiǎn)化。ColorWheel^® 流式抗體的選擇靈活性能讓使用者更加靈活的設(shè)計(jì)多色方案，擺脫由于抗體熒光組合缺失導(dǎo)致的配色困境（詳見(jiàn)表 2）。

圖 3  ColorWheel 流式抗體偶聯(lián)技術(shù)示意

表 2 Colorwheel^® 助力突破傳統(tǒng)多色流式分析的局限

應(yīng)用舉例：

ColorWheel^® 不僅可以簡(jiǎn)化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限，同時(shí)可以保證在多重指標(biāo)的流式實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

以下實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了免疫 T 細(xì)胞檢測(cè)常用的指標(biāo) CD3，CD4，CD44，CD45RA，該 4 重指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估 CD4+ 輔助型T細(xì)胞的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，ColorWheel^® 流式抗體與傳統(tǒng)的流式抗體具有同樣優(yōu)異的表現(xiàn)（詳見(jiàn)圖 4）。

圖 4 ColorWheel 流式抗體與傳統(tǒng)流式抗體的檢測(cè)效果比較（左邊是 ColorWheel^® 結(jié)果，右邊是傳統(tǒng)數(shù)據(jù)）