小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）的培養(yǎng)要點(diǎn)及高效轉(zhuǎn)染

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）是通過Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后得到的細(xì)胞株。其在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用十分普遍，是許多白血病相關(guān)研究模型的常用細(xì)胞株，在微生物學(xué)、免疫學(xué)等研究中也十分常用。但RAW264.7細(xì)胞形態(tài)和分化狀態(tài)多變，在實(shí)際培養(yǎng)中較難把握，給科研工作帶來了一定困難；且RAW264.7細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染，許多研究者表示Lipofectamine 2000根本轉(zhuǎn)不進(jìn)去，或者僅有不到10%的轉(zhuǎn)染效率。因此RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法就很值得去探討，本文就這些方面進(jìn)行介紹，以供科研工作者借鑒。

一、RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)特征

    很多人養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞出現(xiàn)偽足；就連ATCC的描述也稱RAW264.7細(xì)胞形態(tài)多樣，可有圓形、類圓形，以及長(zhǎng)出偽足的長(zhǎng)梭形、多邊形，可單核可多核。而實(shí)際，有偽足的情況是RAW264.7細(xì)胞受到外界刺激進(jìn)行了分化，是細(xì)胞衰老、分化的表現(xiàn)；RAW264.7細(xì)胞的“最佳"形態(tài)應(yīng)是較小的單核圓形細(xì)胞。

二、RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)條件

    RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境與一般貼壁細(xì)胞并無差異。即培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO₂濃度為5%。ATCC推薦的培養(yǎng)基為DMEM+10%的胎牛血清；實(shí)際上，經(jīng)研究者們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖型DMEM培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁更快、細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。因此，推薦使用高糖型DMEM，F(xiàn)BS濃度為10%，作為RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)基。

三、RAW264.7細(xì)胞的傳代

關(guān)于RAW264.7細(xì)胞的傳代方法，ATCC推薦使用細(xì)胞刮刀。也可采用0.25%的胰酶消化或采用彎嘴吸管吹打等方法。采用細(xì)胞刮刀進(jìn)行傳代時(shí)，細(xì)胞能最大限度被收集起來，但會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷、影響細(xì)胞形態(tài)及貼壁時(shí)間等。采用胰酶消化時(shí)，由于RAW264.7細(xì)胞貼壁較牢，消化時(shí)間就較長(zhǎng)。但消化時(shí)間點(diǎn)不易把握，易消化過度，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成抑制。

    因此，推薦使用彎嘴吸管吹打進(jìn)行傳代。具體做法是，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到傳代密度時(shí)，先棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，用彎嘴吸管吸取培養(yǎng)基，均勻、稍用力吹打瓶底，即可將細(xì)胞吹打下來（吹不下來的就不要了），離心后重懸即可分瓶培養(yǎng)。2 h后可見細(xì)胞貼壁。

由于RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，一般1-2d換液1次，密度長(zhǎng)至60%-70%左右即可傳代，傳代比例可為1:3-1:6。若傳代間隔太久，細(xì)胞生長(zhǎng)密度過大，細(xì)胞也容易發(fā)生分化，出現(xiàn)長(zhǎng)偽足的多形細(xì)胞。

四、RAW264.7細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

RAW264.7細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇方法與一般貼壁細(xì)胞并無較大差別。但由于RAW264.7細(xì)胞對(duì)外界刺激較敏感，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求較高，許多人建議降低DMSO的濃度，增加FBS血清的濃度。因此凍存液的推薦配方為5% DMSO和20% FBS的培養(yǎng)基（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞的培養(yǎng)及其在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞中的應(yīng)用，許丹等，中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2016, 10, 22, 10）。

五、RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

（一）以往轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)

    RAW264.7細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞，有很強(qiáng)的貼壁性和偽足產(chǎn)生性，其轉(zhuǎn)染較難，一般采用電轉(zhuǎn)或慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法。有研究者對(duì)RAW264.7細(xì)胞用幾種不同的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行處理，對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofectamine 2000, Invitrogen）效率低，僅為12.17±1.53%，慢病毒轉(zhuǎn)染效率高，可達(dá)34.75 ± 5.30%，羅氏轉(zhuǎn)染（X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent, Roche）和電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別為16.52 ± 3.86%和15.73 ± 3.29%（巨噬細(xì)胞RAW264.7不同轉(zhuǎn)染方法的比較，李亞等，生物技術(shù)，2014, 24, 2）。

（二）最新高效轉(zhuǎn)染試劑

既然RAW264.7細(xì)胞這么難轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)還得繼續(xù)，那怎么辦呢？

不要擔(dān)心，現(xiàn)在ZETA LIFE新推出一款Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑。其廣泛適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，可轉(zhuǎn)DNA、RNA，也可共轉(zhuǎn)染，還可進(jìn)行小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染。

這一款轉(zhuǎn)染試劑有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

1.適用細(xì)胞廣

   廣泛用于293T，9L，A172, A375, A549, COS7, CHO-K1, C6S, C2C12, NIH3T3, RG2, T98G, U87, U118, MDCK, MCF-7, HT1080, HEK, H4, RAW264.7等多種細(xì)胞系。

2.細(xì)胞毒性低

    其最高細(xì)胞存活率可高達(dá)98%，平均細(xì)胞存活率可達(dá)80%。

3.轉(zhuǎn)染效率高

    其最高轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)96%，平均轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%。

（三）Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)RAW264.7的實(shí)例（來自實(shí)驗(yàn)者的實(shí)際數(shù)據(jù)）

由上圖可明顯看出Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)RAW264.7轉(zhuǎn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)95%以上，且細(xì)胞存活率較高。

    相信Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑 將是您對(duì)的選擇，希望能為您的研究助力。