高效率轉(zhuǎn)染人淋巴瘤細(xì)胞的操作方法

轉(zhuǎn)染條件：

培養(yǎng)板：6孔板

轉(zhuǎn)染試劑用量：10ul

核酸用量：電訊

轉(zhuǎn)染試劑：AD600150，Zeta Life Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染時(shí)間：48小時(shí)

血清：Z7180FBS-500超低內(nèi)毒素胎牛血清

細(xì)胞凍存：CE70100T無(wú)血清細(xì)胞凍存液

高效率轉(zhuǎn)染效果圖如下：

操作步驟

提前 1 天接種細(xì)胞：細(xì)胞匯合度在 60-80%左右，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

核酸復(fù)合物制備：將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照 1:1 關(guān)系直接混合，用移液器吹吸 10-15 次混勻，室溫靜 止 10-15 分鐘。

在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核酸復(fù)合物：根據(jù)參考用量在細(xì)胞中加入核酸復(fù)合物，并輕輕混勻；細(xì)胞培養(yǎng)基 里面可以含有血清。

細(xì)胞換液：轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中不用換液。

分析結(jié)果：質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 48-72 小時(shí)后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-96 小時(shí)檢測(cè) mRNA 或蛋白表達(dá)。若進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，則在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí)左右加入適量的藥物進(jìn)行篩選。siRNA 轉(zhuǎn)染后 9 小時(shí)熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-72 小時(shí)檢測(cè) mRNA 或蛋白表達(dá)。

注意事項(xiàng)：

1、質(zhì)粒 DNA 必須溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水，但不能溶解于提取試劑盒提供的 Buffer。溶解于 Buffer 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降 80%左右，甚至?xí)D(zhuǎn)染失敗。

2、質(zhì)粒必須去除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生很大的細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降 70%-80%左 右，甚至導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失?。ㄍ扑]使用 Qiagen、TIANGEN、Omega 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒）。 

3、復(fù)合物的制備過(guò)程中是絕對(duì)不能用其他任何試劑對(duì)核酸或轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行稀釋，只需將核酸和轉(zhuǎn)染 試劑兩者按 1:1 比例直接混合，如果進(jìn)行了稀釋會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失。 

4、轉(zhuǎn)染試劑與核酸混勻后用移液器吹打 10-15 次，室溫孵育 10-15 分鐘后即可加入細(xì)胞培養(yǎng)板。 

5、轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后進(jìn)行正常換液，不能像 Lipo2000 一樣轉(zhuǎn)染 4-6 小時(shí)后換液。 

6、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基里面不能含有雙抗培養(yǎng)基。