傳代細胞培養(yǎng)實驗操作步驟

一、貼壁細胞：HeLa細胞的傳代培養(yǎng)

1. 選取生長密度80%左右的HeLa細胞，在生物安全柜中操作，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL的D-Hanks溶液，漂洗細胞以除去殘留的血清。

2. 吸去培養(yǎng)皿中的D-Hanks溶液，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化2～3 min(如消化程度不夠，可延長時間)，倒置顯微鏡下觀察細胞，當大部分細胞變圓時，輕輕吸去酶消化液（如果有較多細胞漂起，需要直接加入*培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶的消化反應(yīng)）。

3. 加入4 mL*培養(yǎng)基，用移液管反復吹打細胞成為細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。

4. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

5. 接種好的細胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。

6. 細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細胞的生長密度進行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。

二、懸浮細胞或半貼壁細胞的傳代培養(yǎng)

懸浮細胞不貼壁（半貼壁細胞貼壁不緊），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具體過程如下：

1. 取狀態(tài)良好的細胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細胞吹打均勻。

2. 把細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。

3. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

4. 接種好的細胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人．輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。

5. 細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細胞的生長密度進行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。