1. 單個(gè)大腸桿菌克隆接種到 2 ml 含適當(dāng)抗生素的 LB 中。37℃ 劇烈振蕩孵育 5~8 小時(shí)。或者可以培養(yǎng)過(guò)夜使飽和。

2. 倒 1.5 ml 培養(yǎng)液到已作標(biāo)記的微量離心管中。把剩下的培養(yǎng)液存放在 4℃。

3. 在微量離心機(jī)上離心 2 分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養(yǎng)液。

4. 用 100 ul 葡萄糖緩沖液重懸沉淀物。在室溫孵育 5 分鐘。在這時(shí)候充分懸浮大腸桿菌對(duì)于獲得盡可能大的產(chǎn)量是很重要的。

葡萄糖緩沖液（配 500 ml）

50 mmol/L 葡萄糖    4.5 g 葡萄糖

10 mmol/L EDTA，pH 8.0       10 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0

25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0   12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

過(guò)濾除菌，貯存在 4℃。

5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液，輕輕地顛倒混合。冰浴 5 分鐘。溶液應(yīng)該明顯變清了，但仍然非常黏。

NaOH-SDS 溶液（配 50 ml）

0.2 mol/L NaOH   0.4 g NaOH

1% SDS    2.5 ml 20% (w/v) SDS

可在室溫存放 2~3 周。

6. 每個(gè)管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸鉀，pH 5.2，顛倒混合；冰浴 5 分鐘，會(huì)形成白色絮狀沉淀。

3 mol/L 乙酸鉀：

5 moI/L 乙酸鉀 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

加水到 100 ml。貯存在 4℃。

7. 在小離心機(jī)上離心 5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移 400 ul 上清到一個(gè)已作標(biāo)記的管中。

8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/異戊醇（50:49:1) 溶液，振搖，在離心機(jī)上離心 5 分鐘。

酚/氯仿/異戊醇（50:49:1)

50% TE 飽和酚

49% 氯仿

1% 異戊醇

避光貯存于 4℃。

9. 小心地把水相（上層）轉(zhuǎn)移到已作標(biāo)記的管中。

10. 加 1.0 ml 100% 乙醇，混合，然后離心 5 分鐘沉淀 DNA。

11. 去掉上清。應(yīng)該能看到一個(gè)小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗滌沉淀物，并離心 5 分鐘。

12. 去掉上清。管子離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體，讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘。（或者可以真空干燥管子。）

13. 用 25~50 ul 的 TE（pH 8.0）重懸沉淀物。質(zhì)粒 DNA 應(yīng)該很容易溶解。不易溶解的物質(zhì)很可能不是 DNA。

14. 在這 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000。混合均勻并冰浴 1 小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

15. 用小離心機(jī)在 4℃ 離心 15 分鐘以沉淀 DNA。

16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗滌沉淀物，離心 5 分鐘。

17. 小心去掉乙醇，離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體并讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘。

18. 根據(jù)測(cè)序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重懸沉淀物。

純化質(zhì)粒（堿裂解法）

材料與儀器

步驟

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