如何做非肌肉肌球蛋白的層析純化？

時(shí)間：2021/11/24閱讀：1280

材料與儀器

非肌肉肌球蛋白
勻漿緩沖液肌動蛋白聚合緩沖液凝膠過濾羥基磷灰石緩沖液 GF HT 緩沖液
大容量轉(zhuǎn)頭

步驟

高速離心和 DEAE 層析

1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制劑的勻漿緩沖液平衡 DEAE 纖維素，取 50 ml 裝到 2.5cm x 35cm 有合適管路的柱子上。

2. 準(zhǔn)備總體積為 0.8 L，線性梯度為 0~0.5 mol/L KCl 的勻漿緩沖液。

3. 用大容量轉(zhuǎn)頭（例如 Ti 647.5，它帶 6 個(gè) 70 ml 容量的聚碳酸酯桶）以 43000 r/min，137600 g 超速離心 2 小時(shí)，從已勻漿的細(xì)胞中沉淀細(xì)胞碎片。

4. 盡可能多地轉(zhuǎn)移清亮的上清，不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪殘?jiān)?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.48rem !important; margin: 0px !important;"/>
5. 混合 100 ml 上清和 100 mI DEAE-纖維素（已如上所述用勻漿緩沖液預(yù)先平衡）可以一次性地把清亮的上清樣到 DEAE 上。DEAE-蛋白混合物倒進(jìn) 2.5cm x 35cm 的預(yù)先裝了 50 ml 用勻漿緩沖液和 PMSF平衡的 DEAE-纖維素的柱子。

6. 立即開始分部收集（每管 8.5 ml )。

7. 用 3~5 倍體積的勻漿緩沖液洗柱子，用 0.8~1 升 KCl 梯度為 0~0.5 mol/L 的勻漿緩沖液進(jìn)行洗脫。

8. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性（K+EDTA 或 Ca2+ 活性峰）、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析.

9. 把從 DEAE 層析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。

非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌動蛋白共沉淀

10. 準(zhǔn)備下列貯存液。

1 mol/L KCl

0.1 mol/L MgCl2

溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層：

300 mg/ml 蔗糖

50 mmol/L KCl

2 mmol/L MgCl2

10 mmol/L 嘧唑-HCl，pH 7.0

11. 計(jì)算所需的外源肌動蛋白量，使混合的 DEAE 收集液中肌動蛋白的終濃度為 0.125 mg/ml。所需肌動蛋白體積(ml)由下式給出：

VA= ( 0.125 x Vpool）/ [ ( 肌動蛋白）-0.125]

( 肌動蛋白）是在緩沖液 A 中 G-肌動蛋白貯存液的濃度，單位 mg/ml。

12. 量出所需 G-肌動蛋白的量（使用 1~8 mg/ml 溶于緩沖液 A 中的肌動蛋白，用肌動蛋白制備中所述的方法獲得），并通過和適當(dāng)體積的 50x 肌動蛋白聚合緩沖液（所加的體積=VA/50）混合并在室溫培養(yǎng) 10~20 分鐘來使它聚合。

50x 肌動蛋白聚合緩沖液：

2.5 mol/L KCl

1 mol/L MgCl2

3 mmol/L NaN3

13. F-肌動蛋白和 DEAE 收集液混合（步驟 9 )，使 MgCl2 濃度為 2 mmol/L。

14. 加入足量的 1 mol/L 葡萄糖使終濃度為 50 mmol/L ( 加 50 μl/ml )，然后加己糖激酶使終濃度為 1 單位/ml（0.25 μl/ml）。室溫下攪拌 5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移到 0℃ 過夜（幾小時(shí)可能就足夠了）。

15. 在超速離心管中裝 1/3 溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層，把含僵硬的肌動球蛋白復(fù)合物的樣品鋪到墊層上面。離心 3 小時(shí)沉淀肌動球蛋白。

通過不連續(xù)凝膠過濾從外源肌動蛋白中分離肌球蛋白

16. 準(zhǔn)備用于凝膠過濾的貯存液和材料

4x 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液：

200 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

20% 蔗糖

8 mmoI/L K+EDTA，pH 7.0

12 mmol/L NaN3

可以貯存在 4℃。

2x GF/HT 緩沖液：

4X GF/HT 緩沖液，100 ml

0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0，10 ml

DTT，62 mg

用 dH2O 加到 200 ml 。

KI 凝膠過濾緩沖液：

2x GF/HT 緩沖液，20 ml

Kl，4.78 g

用 dH2O 加到 40 ml。

KCl 凝膠過濾緩沖液：

2x CF/HT 緩沖液，180 ml

KCl，16.10 g

用 dH2O 加到 360 ml。

17. 備一個(gè) 1.5 x 85 cm 的用 KCl 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液平衡了的 A15-m 瓊脂糖凝膠過濾柱。

18. 離心步驟結(jié)束的時(shí)候，在凝膠過濾柱上加 12~19 ml KI 緩沖液。

19. 倒掉上清和蔗糖，留下肌動球蛋白沉淀物，然后在冰庫中把管子倒轉(zhuǎn)在紙巾上 5~10 分鐘，小心地使液體流干。用棉簽去掉多余的液體。

20. 處理沉淀：

(1) 用不銹鋼刮刀挖出沉淀。

(2) 在 4.3 ml KI 緩沖液中用一個(gè) 7 ml 的帶緊的研杵的 Dounce 勻漿器進(jìn)行勻漿。

(3) 超速離心（50Ti 轉(zhuǎn)頭，30000 r/min 63400 g）30 分鐘使樣品變清。

(4) 仔細(xì)地轉(zhuǎn)移上清，不要帶任何沉淀碎片。

(5) 立即把樣品加到凝膠過濾柱上并用 KCI 凝膠過濾緩沖液跑柱子。

21. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析。混合含肌球蛋白的收集液。洗脫天然肌球蛋白-II 的分配系數(shù)應(yīng)該是 0.13~0.14。

羥基磷灰石層析

22. 準(zhǔn)備進(jìn)行羥基磷灰石層析的貯存液和材料。

預(yù)先在 GF/HF 緩沖液中平衡了的羥基磷灰石（2~4 ml）

線性梯度，總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4，pH 7.0

0.6 mol/L K+PO4，pH 7.0

23. 準(zhǔn)備一個(gè) 1x 5 cm 的有合適管路的柱子。

24. 對收集液的進(jìn)一步純化是重復(fù)肌動蛋白親和及凝膠過濾步驟或接著用經(jīng)基磷灰石層析。

25. 收集液和預(yù)先平衡好的羥基磷灰石（每毫升羥基磷灰石 12~20 ml 收集液）混合在一起，然后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜（短一點(diǎn)時(shí)間可能也夠）。

26. 把蛋白/羥基磷灰石混合物倒到一個(gè)小柱子（1x5 cm) 中，用 5~10 倍體積的 CF/HF 緩沖液洗，然后用總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4 線性梯度，pH 7.0 洗脫。肌球蛋白Ⅱ在大約 200~220 mmol/L K+PO4，pH 7.0 處洗脫下來。

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