siRNA轉(zhuǎn)染和干擾效果不佳的問題。
要保證RNA干擾的效果就必須保證siRNA能夠成功的轉(zhuǎn)染到細胞中去，那有時候會轉(zhuǎn)染不進去，原因可能有如下幾點：1、轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染siRNA濃度太低。FAM驗證轉(zhuǎn)染效率時siRNA(FAM)的量的終濃度是50-150nM都可以，需要根據(jù)細胞進行摸索。lipo2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。建議用24孔板摸索條件。siRNA所加的量及其濃度可以根據(jù)實驗自己調(diào)整，按照要求配成20uM的濃度，那1ul就是20pmol,在1ml細胞培養(yǎng)液中加1ul,那終濃度就是20nM,加2ul就是40nM，以此類推。24孔板摸濃度后，用6孔板時把轉(zhuǎn)染體系相應(yīng)放大即可。實驗中需要注意細胞狀態(tài)要好，代數(shù)不要太大，細胞密度適中，50%左右（根據(jù)的細胞生長情況調(diào)節(jié)），鋪板時要鋪均勻，添加轉(zhuǎn)染復合物時要小心滴加。轉(zhuǎn)染時建議不要使用雙抗和血清，雙抗轉(zhuǎn)染時對細胞有毒性，會導致細胞狀態(tài)不好，血清會降低轉(zhuǎn)染效率。2、轉(zhuǎn)染試劑：轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇較為適合實驗設(shè)計的轉(zhuǎn)染試劑?？赡芗毎麑ipo2000不是太敏感，建議更換其他的轉(zhuǎn)染試劑，例如ZETA LIFE Advanced系列轉(zhuǎn)染試劑，采用第三代多肽小分子材料，轉(zhuǎn)染的效率非常高，尤其轉(zhuǎn)siRNA效果非常好。a、轉(zhuǎn)染效率跟細胞狀態(tài)、細胞代數(shù)、細胞密度等有關(guān)，一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。最這適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結(jié)果。b、有的細胞不太好轉(zhuǎn)染，比如懸浮、干細胞、原代細胞等，可查找相關(guān)文獻，看別人做這種細胞時用的什么方式。如果細胞不好轉(zhuǎn)，就要考慮換一種方式進行您的實驗了，比如說用病毒、電轉(zhuǎn)等。
下圖是轉(zhuǎn)染FAM標記的siRNA后的前列腺癌細胞所拍的圖片，轉(zhuǎn)染進去的整個細胞是綠色的，可以清晰的看到細胞形態(tài)，沒有轉(zhuǎn)染進去的就是綠色的小點兒。
如果通過上邊的問題驗證到siRNA的確是可以轉(zhuǎn)染進細胞，但干擾效果又不理想的話那么可能的原因如下：
1、轉(zhuǎn)染效率問題。如果少量siRNA進入細胞，作用于基因后，有時候細胞會有補償機制，表達量反而升高。建議在實驗前，先檢測一下轉(zhuǎn)染效率，觀察一下，轉(zhuǎn)染進去的整個細胞是綠的，沒有轉(zhuǎn)染進去的是一些綠色的小點粘附在細胞上，發(fā)的光是點狀的。建議多做幾個轉(zhuǎn)染梯度，找到最佳轉(zhuǎn)染條件。2、檢測時間點。建議轉(zhuǎn)染后24-48小時檢測RNA水平變化，48-72小時檢測蛋白水平變化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干擾是拋物線形的，多做幾個時間點有利于siRNA干擾效果的測定。3、推薦RT-PCR的引物應(yīng)該設(shè)計在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導的基因knockdown機制是RSIC先介導靶mRNA的切割，切割導致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時間點，因此，設(shè)計于同側(cè)的PCR引物可能導致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。4、RNA降解。建議-20保存，溶解后要最小量分裝，-20或者-80保存，3個月內(nèi)用完，避免反復凍融或者4度保存。干粉保存最長最好不要超過6個月。
5、基因問題。有的基因受細胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，mRNA能敲除，但是蛋白水平敲除不下來的，如果這樣，建議換一種細胞看看。
6、干擾靶點不合適。需重新設(shè)計siRNA。
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