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哺乳動物細(xì)胞基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗

時間：2021/12/14閱讀：1144
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材料與儀器


哺乳動物細(xì)胞
*培養(yǎng)液
培養(yǎng)箱 離心管


步驟


1.  確定所要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能呈獨立集落生長。對于貼壁細(xì)胞，在10 cm 組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿中接種約100個細(xì)胞，培養(yǎng)10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍(lán)染色后對成活的細(xì)胞集落進行計數(shù)。

 
2.  確定母代細(xì)胞的選擇條件：將一培養(yǎng)皿上生長匯片的細(xì)胞按不小于1：15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10天。用合適的選擇培養(yǎng)液每4天換液1次， 并檢查活細(xì)胞。
 
3.  確定轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞的*的方法?？蛇x用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染，在加DNA的前1天，將母代細(xì)胞按1：15分傳中*培養(yǎng)液中。
 
4.  用目的基因轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞，含目的基因的質(zhì)粒與含標(biāo)記基因的質(zhì)粒的摩爾比例不小于5：1。用擔(dān)體DNA替代含有目的基因的質(zhì)粒作為對照，分別進行幾次轉(zhuǎn)染。
 
5.  在無選擇條件下讓細(xì)胞倍增2次。將細(xì)胞按1：15分傳于選擇培養(yǎng)液中。
 
6.  在選擇培養(yǎng)液中接種5個以上培養(yǎng)皿，以得到盡可能多的能挑取和擴增成細(xì)胞系的細(xì)胞集落數(shù)，每4天用選擇培養(yǎng)液換液，培養(yǎng)10~12天，將培養(yǎng)皿對著光成一角度觀察其中的細(xì)胞克隆，其中的一只培養(yǎng)皿直可進行染色以便于計算細(xì)胞集落數(shù)。挑取大的、生長良好的細(xì)胞集落。


注意事項


如果用5：1的比例，沒有必要在轉(zhuǎn)染前將透擇標(biāo)記基因與目的基因連接起來：如果選擇需要用大量的選擇性質(zhì)粒，有時無態(tài)保證5：1比例，故要將選擇標(biāo)記基因及所要研究的目的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中。如果用含有所研究的基因進行轉(zhuǎn)染沒有形成克隆，而在含有的對照中卻可產(chǎn)生究隆，則所研究的基因能有細(xì)胞毒性。


以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。


安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。


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