純化的RNA的點雜交和狹線雜交

時間：2021/12/21閱讀：1382

原理

點雜交和狹線雜交技術（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過估計樣品點發(fā)射出的信號的強度，與已知濃度的標準品信號強度進行比較，確定待測樣品中靶序列的量。

材料與儀器

RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照探針標記與變性
NaOH 預雜交液 RNA 變性液 SSC
印跡裝置絞鏈儀帶正電荷尼龍膜厚印透紙水浴鍋

步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

NaOH ( 10 mol/L)

預雜交液

RNA 變性液

0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)

0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

2X SSC

20X SSC

2. 核酸與寡聚核甘酸

RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照

3. 探針

探針標記與變性

4. 專用設備

印跡裝置

絞鏈儀（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空爐、微波爐

帶正電荷尼龍膜

厚印透紙（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

預熱水浴鍋到 68℃

二、方法

安裝印跡裝置

1. 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標上表示方向的記號。用水把膜簡單弄濕，在 20X SSC 中室溫泡 1 h。

2. 在膜浸泡期間，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印跡裝置，再用無菌水洗干凈。

3. 把兩片厚濾紙用 20X SSC 浸濕，再放到真空器頂部。

4. 把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

5. 加緊夾板，連接真空管。

6. 加入 10X SSC 直至液面沒過尼龍膜，關掉真空，再用 10X SSC 充滿。

RNA 樣品準備

7. 把每個 RNA 樣品（溶解在 10 μl 水）分別與 30 μl RNA 變性液混合。

8. 65℃ 溫育 5 min，然后在冰上冷卻。

9. 向每個樣品中加入等體積 20X SSC。

10. 輕輕向印跡裝置中吸入 10XSSC，直到淹沒尼龍膜。

RNA 樣品的印跡和 RNA 在膜上的固定

11. 把所有樣品輕輕加入狹線中，然后輕輕吸干膜。當所有樣品都鋪到膜上后，每個狹線用 1 ml 10XSSC 洗兩次。

12. 當?shù)诙蜗茨ね瓿珊?，繼續(xù)輕輕吸干膜。

13. 取下膜，然后用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

固定化 RNA 的雜交與洗膜

14. 把膜放入烤盤或雜交爐中，加入 10~20 ml 預雜交液 68℃ 溫育 2 h。

15. 把已變性的放射性標記的探針直接加到預雜交液中。在適當?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育 12~16 h。

16. 雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉移到室溫下裝有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖 10 min。

17. 把膜轉移到另一個裝有 100~200 ml 的、預熱到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖 10 min。

18. 按步驟 17 重復洗膜兩次，使總的洗膜次數(shù)達到三次。

19. 用濾紙吸干膜，在 -70℃ 條件下放射自顯影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相當?shù)哪z片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當然，磷光成像儀也可以用來成像。

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