T、B淋巴細(xì)胞分離

時(shí)間：2022/3/11閱讀：1222

原理

淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡(jiǎn)稱(chēng)AET）處理的綿羊紅細(xì)胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細(xì)胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E-花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E-花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時(shí)，AET-E花環(huán)易沉于管底，而未形成E-花環(huán)的T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周?chē)?AET-SRBC，便可獲得純T淋巴細(xì)胞，而B(niǎo)淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。

材料與儀器

新鮮豚鼠血
Hanks液小牛血清 199培養(yǎng)液生理鹽水氯化鈉溶液
離心管離心機(jī)

步驟

1. AET-RRBC制備

（1）AET溶液的制備

稱(chēng)取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143 M 溶液，用4N NaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

（2） AET處理RRBC

取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無(wú)菌生理鹽水至離心管口（1~2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3-5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET-RRBC粘附成團(tuán)，并觀察有無(wú)溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，最后配成10%AET-RRBC懸液，置4℃保存，不得超過(guò)5天。

（3）1%AET-RRBC的配制：

將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET-RRBC，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。

2. 從新鮮豚鼠血液分離單個(gè)核細(xì)胞，操作見(jiàn)后試驗(yàn)。

3. AET—E花環(huán)試驗(yàn)：

將分離的單個(gè)核細(xì)胞（2x106/毫升）與等量1%AET-RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

4. T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離

將形成E-花環(huán)的細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細(xì)胞，即為富含B淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的E-花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E-花環(huán)周?chē)腞RBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細(xì)胞群。

注意事項(xiàng)

1. 分離B細(xì)胞過(guò)程較長(zhǎng)，為了避免B細(xì)胞自然死亡，在最后沖洗B細(xì)胞時(shí)可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。

2. 每次洗滌時(shí)，不要將試管底部液體吸干，即防止壓積的B細(xì)胞接觸空氣。

3. 使用抗B淋巴細(xì)胞血清與受檢細(xì)胞按NIH方法進(jìn)行微量B細(xì)胞毒試驗(yàn)，使用倒置相差顯微鏡讀數(shù)。

常見(jiàn)問(wèn)題

關(guān)于從小鼠脾臟中分離：

1.脾臟組織所含結(jié)締組織比較少，可以直接在篩網(wǎng)上研磨，無(wú)需剪碎，也不用顧慮血管。

2.ficoll中含多聚糖，所以許多人喜歡把它放4度存放，是否室溫對(duì)實(shí)驗(yàn)影響不大脾臟分離淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，所以用普通的淋巴細(xì)胞分離液就行。

3 .離心2000rpm×20min，這步很關(guān)鍵，還有就是加細(xì)胞懸液時(shí)一定要貼壁緩慢加入，不要破壞分界面，分離液與細(xì)胞懸液我常用1：2，還有就是所選用的離心管粗細(xì)也會(huì)影響分層。

4.中間的懸浮白色環(huán)狀細(xì)胞層即是所要的淋巴細(xì)胞層。

5.洗細(xì)胞主要是洗去分離液，所以不能省去。

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