怎么使用GSIS方法檢測細胞胰島素分泌

Min6細胞是這次贈送活動中很多客戶選擇的細胞，一共送出去有50多株，隨之而來的就是問胰島素的檢測，很多客戶檢測出來只有低表達。

Min6細胞培養(yǎng)需要注意三點：

1.細胞易聚團，消化的時間表面上看會非常短暫，大約30秒會全部脫落，脫落后請延長消化時間到2分鐘后，再中和，細胞后期聚團會減少。

2.活細胞運輸?shù)臅r候會漂浮，請收集培養(yǎng)基離心，離心后重新鋪板以完-全培養(yǎng)基剛沒過細胞為準，完-全培養(yǎng)基加太多會導致細胞浮力過大，貼壁不上。

3.培養(yǎng)基請一定要加0.05mm的β-Mer

以下是我們檢測使用的buffer和protocol，步驟不能少，一步一步的來。

Buffer的配制：

NaCl 114mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, MgSO4-7H2O 1.16mM, NaHCO3 25.5mM, CaCl2 2.5mM, HEPES 20mM, 0.2% BSA --> pH 7.2-7.5（一定要控制PH值范圍）

操作步驟：以2mM glucose 和25mM glucose 為例:

細胞鋪板每孔大約2000個細胞，鋪板前三天左右脫抗生素采用滅活血清+β-Mer培養(yǎng)1640+10%FBS(滅活）+0.05mm β-Mer；在96孔板中培養(yǎng)24小時，然后將培養(yǎng)基改為含2mM葡萄糖培養(yǎng)基過夜。

1.去除培養(yǎng)基，1 x PBS清洗細胞5分鐘

2.基礎緩沖液(2mM 葡萄糖) ，2小時孵育 -- > 培養(yǎng)

3.去除上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

4.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時孵育

5.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

6.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時孵育；

7.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

8.上清液取樣 -- > 1500轉，5 min，4度；

9.細胞裂解---- > 蛋白質(zhì)定量---- > 上機

以下為檢測結果：

注意點：

為了確保細胞分泌的胰島素混合到上清液樣本中，可以在培養(yǎng)期間在100-300轉的平板振蕩器上輕輕攪動細胞。

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