直接從生物體內(nèi)獲取組織細(xì)胞進(jìn)行的首-次培養(yǎng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步，是從事培養(yǎng)工作的人員應(yīng)熟悉和掌握的最基本的技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)方法不同分為組織塊培養(yǎng)法和單層細(xì)胞培養(yǎng)法。

材料與儀器

小鼠
DMEM DMEM 胰酶 PBS
飯盒紗布小剪子小鑷子大鑷子大燒杯平皿研磨玻片濾網(wǎng) 離心管 6 孔培養(yǎng)板吸管移液管手套微量加樣器

步驟

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將小鼠斷頸致死，置 75%酒精泡2-3 秒鐘，取肝臟，置于盛有 PBS 的平皿中。

2. 剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有 PBS 液的平皿中。

3. 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約 1mm2)，玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心(1000 rpm，5 min)。

4. 視組織或細(xì)胞量加額加入5-6 倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化 20 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。

5. 加入3-5 ml 含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。

6. 用100 目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。

7. 再次離心5 min，棄上清液。

8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。

9. 加入含血清的培養(yǎng)液 1-2 ml (視細(xì)胞量)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

10. 將細(xì)胞調(diào)整到5x105/ml 左右，轉(zhuǎn)移至6 孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1. 自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。

2. 在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。

3. 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細(xì)菌落入。

4. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈工作臺(tái)后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。

5. 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。

7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上的用品擺放要布局合理。

8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

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小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

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