一氧化氮合酶組化顯示法

時間：2023/1/13閱讀：1183

簡介

細胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍（NBT），使后者還原成藍黑色沉淀。

原理

一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本原理是細胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍（NBT），使后者還原成藍黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。

材料與儀器

器材：

染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠。

試劑：

①孵育液（NADPH、NBT）

（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑藍(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;

②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）

（磷酸二氫鈉（NaH2PO4•2H2O），3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O），29 g ；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;

③1％Triton X-100。

④3％Triton X-100

⑤1％中性紅

⑥梯度乙醇

⑦0.01 mol ／ L PBS

⑧4％多聚甲醛

⑨中性樹膠

步驟

一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本過程可分為如下幾步：

（一）腦組織冰凍切片

A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）。

B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重復(fù)3 次。

C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室溫，預(yù)浸60 min 。

D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。

E．3％Triton X-100,4 ℃ ，過夜。

F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復(fù)3 次。

G．裱片，風(fēng)干。中性紅復(fù)染。

H．常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

（二）細胞爬片或甩片

A．細胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復(fù)3 次。

B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。

C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重復(fù)3 次。

D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作。

E．中性紅復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

注意事項

1．冰凍切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分進入組織。

2．本方法屬于酶組化，要選擇適當?shù)墓潭ㄒ汉颓‘數(shù)墓潭〞r間和方法，否則會影響酶的活性。

3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預(yù)浸時間不能超過2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％，否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和多種免疫細胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細胞治療的生物科技企業(yè)。

一氧化氮合酶組化顯示法

（一）腦組織冰凍切片

（二）細胞爬片或甩片

會員登錄

收藏該商鋪

提示