劃痕實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞遷移）的實(shí)驗(yàn)流程及經(jīng)驗(yàn)分享

簡(jiǎn)介：
細(xì)胞遷移(Cell migration)：因其類似體外傷口愈合過(guò)程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)，是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)?？捎糜诳梢杂^察藥物、基因等外源因素對(duì)細(xì)胞遷移、修復(fù)和相互作用的影響。
 

原理：
在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口"，劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口"愈合，于細(xì)胞遷移過(guò)程中在開(kāi)始和定期捕獲圖像，通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕間距并計(jì)算差值，可對(duì)細(xì)胞的遷移能力做出判斷。

材料及儀器：
耗材：六孔板、馬克筆、直尺、200ul槍頭、PBS、（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.劃線：于六孔板底面，馬克筆順直尺畫(huà)三條橫線作為標(biāo)記線。

2.種板：根據(jù)分組種板，細(xì)胞密度為5x105個(gè)/孔左右。并務(wù)必鋪勻。

3.劃痕：待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用直尺比著，200ul槍頭垂直于孔板和畫(huà)的標(biāo)記線劃兩條垂線，使劃痕與標(biāo)記線相交，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)。

4.清洗：棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤(rùn)洗兩到三次，直到劃下來(lái)的細(xì)胞沖洗干凈。

5.加液：根據(jù)分組分別加入加藥培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基。

6.拍照觀察：劃痕、清洗、加液完成后，用顯微鏡拍不同倍數(shù)的照片，作為0h對(duì)照。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所需時(shí)間點(diǎn)取出細(xì)胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。

7.數(shù)據(jù)分析：一種是統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移的距離，一種是統(tǒng)計(jì)劃痕面積。都可以用ImageJ軟件來(lái)進(jìn)行分析。

注意事項(xiàng)或經(jīng)驗(yàn)分享：

1.直尺和馬克筆等工具用前務(wù)必照紫外消殺。
2.種板所用細(xì)胞數(shù)目可根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)快慢調(diào)整接種數(shù)量。保證每組細(xì)胞鋪板密度一致，保證每孔務(wù)必鋪勻。
3.提前用馬克筆畫(huà)好線，避免細(xì)胞種板后不好操作。槍頭畫(huà)線之前，不要棄去原培養(yǎng)基，否則劃下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)塊會(huì)堆積在劃痕邊緣上堆積導(dǎo)致寬度不統(tǒng)一。
4.用槍頭畫(huà)線時(shí)，要用力均勻一致，垂直穩(wěn)定一氣呵成，避免寬度差別較大不利于結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。
5.根據(jù)交叉點(diǎn)定位拍照，避免了前后觀察時(shí)位置不固定的問(wèn)題，結(jié)果更有說(shuō)服力。
6.務(wù)必清洗干凈劃下來(lái)的活細(xì)胞，避免在拍照期間細(xì)胞貼壁在劃痕處并進(jìn)行增殖影響結(jié)果。
7.0h拍照時(shí)可以在試驗(yàn)記錄本上標(biāo)記拍照位置，以便下各時(shí)間段拍攝同一位置。
8.拍照時(shí)注意不要露出馬克筆畫(huà)的線條，不要鏡頭過(guò)于模糊，盡量不要選擇邊緣的光影差別過(guò)大的位置，切換鏡頭時(shí)不要忘記換標(biāo)尺，否則都會(huì)影響結(jié)果的自動(dòng)分析。
9.根據(jù)細(xì)胞種類，選擇無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基來(lái)降低細(xì)胞增殖的影響，或用Mitomycin（1μg/ml）處理1h，抑制細(xì)胞的分裂，消除增殖的影響。但同時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞遷移的速度。
10.一般拍照時(shí)間為0，2，4，6，8，10，12，16，24小時(shí)等選取，不建議超過(guò)24h，過(guò)度增殖造成實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
11.手工劃痕可能難以保證寬度一致性，culture Insert是現(xiàn)在市面上也推出的一種可以提前占據(jù)劃痕區(qū)域的模具，將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert產(chǎn)生筆直且無(wú)細(xì)胞損傷的劃痕。
12.分析結(jié)果中長(zhǎng)度法，由于細(xì)胞遷移并不是齊頭并進(jìn)的，可能組間差異大，建議用平均多條距離的值來(lái)代表。

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