24條細胞培養(yǎng)經(jīng)驗

什么是細胞培養(yǎng)？

細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。

不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細胞培養(yǎng)都是一個非常重要的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆。細胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)中十分重要的環(huán)節(jié)，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。

細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

細胞培養(yǎng)總會遇到細胞污染、胞質(zhì)疏松，狀態(tài)不好，養(yǎng)不起來等等問題。接下來就給你們介紹一些常見問題解決方法。

細胞培養(yǎng)的菜鳥問題集

1.冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

2.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養(yǎng)基，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞可能無法立即適應(yīng)，導(dǎo)致細胞狀態(tài)不好甚至死亡。

4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5. 培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用多少濃度的CO2？5%還是10%，或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應(yīng)使用5% CO2 培養(yǎng)細胞。

6. 何時須更換培養(yǎng)基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

7. 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素，但實際操作中有時會加入1%的青鏈霉素來避免細菌污染。

8. 貼壁細胞繼代時該使用多少濃度的trypsin-EDTA？

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一般使用濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。

9. 懸浮細胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需在原培養(yǎng)瓶中持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多，可將培養(yǎng)瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

10. 一般動物細胞的離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為300 g (約1,000 rpm)，5-10分鐘，過高轉(zhuǎn)速將造成細胞死亡。

11. 合適的細胞接種密度是多少？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦可能會導(dǎo)致細胞生長過慢。

12. 細胞冷凍培養(yǎng)基的成份是哪些？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C預(yù)冷。

13. DMSO的等級和無菌過濾方式？

冷凍保存使用的DMSO等級必須為Tissue culture grade，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，避光保存。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO的Nylon材質(zhì)濾膜。

14. 細胞凍存的步驟是什么？

凍存方法一：冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

凍存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，但存活率會降低。

15. 凍存時細胞密度為多少比較合適？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106cells/ml vial為宜。

16. 應(yīng)如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。造成細胞污染的主要原因有無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、實驗耗材污染、血清污染和細胞來源污染等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境和品質(zhì)良好的細胞來源是避免污染的最好方法。

17. 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

18. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響細胞所有的生長參數(shù)。故進行實驗前，必須確認(rèn)細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果方有意義。

19. 偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？

直接滅菌后丟棄是最佳的方法，以避免污染其它細胞株。但如果樣品比較珍貴，可以購買市面上現(xiàn)有的支原體去除試劑，嘗試拯救一下。

20. CO2培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔？

定期更換無菌蒸餾水或無菌去離子水(至少每兩周一次)。

21. 為何培養(yǎng)基保存于4 °C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存在4 °C冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。

22. 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但對大部分細胞沒有太大之影響，只有少數(shù)細胞可能會因使用不同廠牌的dish或flask而表現(xiàn)出生長差異。

23. 購買的細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少的情形？

研究人員在解凍細胞后出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

24. 購買的細胞出現(xiàn)死亡率高或狀態(tài)不佳的可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認(rèn)為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C太久。

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