原位雜交實驗流程

原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)簡稱原位雜交，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。

一、合成RNA探針

1、設(shè)計探針引物

RNA探針長度500bp最為合適。一輪引物不添加啟動子序列，二輪引物在正向引物的5端加上T7啟動子序列，在反向引物的5端加上SP6啟動子序列。

2、探針合成

用未添加啟動子序列的引物克隆出探針序列的DNA模板，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證。膠回收，將其連接到T載體上，轉(zhuǎn)化涂板，進(jìn)行質(zhì)粒提取送測。用添加了T7和SP6啟動子序列的引物再次給探針序列兩端添加上啟動子序列。取一輪以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳驗證，若條帶單一明亮，膠回收PCR產(chǎn)物用于后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄。

3、體外轉(zhuǎn)錄

利用PCR擴(kuò)增出的帶有啟動子序列探針的DNA模板，分別用相應(yīng)的RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到單鏈RNA探針。探針包括正義探針和反義探針，用正義探針(T7RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄得到)進(jìn)行的原位雜交實驗作為陰性對照組，用反義探針(SP6RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄得到)進(jìn)行的原位雜交實驗為實驗組。體外轉(zhuǎn)錄體系如下:

混勻后37，孵育2小時。

4.質(zhì)量檢測、中止消化

轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取1ul轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳條帶明亮不彌散則進(jìn)行下一步。驗證后，每管加入2DNase，37消化15min，去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)終止消化反應(yīng)。

5.沉降洗滌保存

每管用DEPC水補(bǔ)至100uL，加入2倍體積的的無水乙醇和1/10體積的的3M乙酸鈉，置于-80℃沉降過夜/-20℃沉降30分鐘。將沉降后的體系放入離心機(jī)中，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清。加入100uL70%無水乙醇浸洗，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清，在超凈臺風(fēng)干。將沉淀的RNA探針加入DEPC水溶解，使其濃度為10ng/uL，分裝后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

注意事項：

（1）DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是 RNA 酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在各步處理中，所有液體試劑都應(yīng)經(jīng) DEPC 處理。

（2）含有 Tris緩沖液的溶液中，不能加入 DEPC。

（3）原位雜交引物用同一個遺傳背景的個體克隆全長測序成功，在測序成功的全長序列上設(shè)計引物，保證特異性。

二、雜交

1、準(zhǔn)備工作

①圓形細(xì)胞爬片在濃鹽酸中浸泡過夜，經(jīng)超純水沖洗后，浸泡在無水乙醇中；②將圓形細(xì)胞爬片、玻璃培養(yǎng)皿、金屬鑷子180℃高溫烘4h去除RNase；③取出后靜置1h冷卻，培養(yǎng)皿中加入0.1mg/ml多聚賴氨酸處理。④正、反面各避光浸泡15min；⑤ 用鑷子依次夾取玻片，迅速蘸取DEPC水，正面朝上放在錫箔紙折起的褶皺上，37℃放置3h備用。

2、組織包埋與切片

原位雜交實驗組織石蠟包埋，將包埋好的蠟塊從-20℃取出，刀片、臺面、切片機(jī)等用RNase抑制劑噴霧噴灑擦凈，修整好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切片厚度設(shè)置為5μm，將蠟帶在43℃ DEPC水中水浴展開，用多聚賴氨酸處理過的圓形玻片撈取蠟帶，置于錫箔紙褶皺上37℃烘干過夜。

3、脫蠟與復(fù)水

鑷子夾取圓形玻片依次于下述玻璃培養(yǎng)皿中：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脫蠟→二甲苯：乙醇（1:1） 6min→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度復(fù)水。

4、預(yù)雜交

①鑷子夾取圓形玻片至24孔板中，每孔加入500μl DEPC水洗滌4min；②加500μl PBST（1×PBS+0.1%Tween-20)洗滌10min，洗2次；③加300μl 2μg/ml蛋白酶K，37℃消化12min；④加500μl 0.1M TEA孵育10min；⑤加500μl PBST 10min，洗滌兩次；⑥加500μl 4%的多聚甲醛，避光固定20min；⑦加500μl PBST，10min，洗滌兩次；⑧加300μl HB雜交液，60℃預(yù)雜交4h。

HB雜交液的配制：

HB現(xiàn)用現(xiàn)配，本次實驗一次配制3份。

5、探針變性與雜交

將200ng探針加入到30μl HB雜交液中，95℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻，然后加入到270μl已60℃預(yù)熱的裝有HB雜交液中1.5ml 無酶管中，充分混勻后加入到樣品孔中，60℃雜交17h。

6、洗脫探針

洗脫探針?biāo)迷噭┚?7℃/60℃預(yù)熱，并在相應(yīng)環(huán)境中洗脫。

洗脫探針條件

7、封閉、抗體孵育

①向樣品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗滌10min，洗滌兩次。②加入300μl Blocking bufferr（1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20）避光封閉1.5h。③按照1：3000比例將Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗體加入到Blocking buffer中，充分混勻后吸取 300μl 加入樣品孔，避光孵育 1h。

8、洗滌抗體

向樣品孔加入500μl MaNaT洗滌抗體,避光洗滌5min重復(fù)2遍，再加入500μl MaNaT洗滌抗體，避光洗滌15min重復(fù)4遍。

9、顯色及終止反應(yīng)

吸出 MaNaT，加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗滌兩次，每次5min；按1:50的比例將 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中，充分混勻后吸取 400μl 加入樣品孔，避光顯色10min，鏡檢觀察到藍(lán)紫色信號時，吸出顯色液。

10、復(fù)染

吸出 PBST，加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min；吸出固定液，加入 500μl PBST 洗滌兩次，每次 10 min；吸出 PBST，加入 300μl 1%中性紅染液復(fù)染。

11、封片

復(fù)染后，用鑷子夾取玻片，依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脫水；在 100%無水乙醇：二甲苯(1:1)中處理浸泡2min；在二甲苯中浸泡5 min；最終以中性樹膠封片。

12、顯微觀察

使用 1 至 4 倍放大倍數(shù)觀察組織雜交整體信號表達(dá)情況，使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍數(shù)觀察局部雜交信號，拍照。

A, B:斑馬魚中某基因正義RNA探針信號分布；

C, D: 斑馬魚中某基因反義RNA探針信號分布。

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