實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)--RNA模板的制備

常見的RNA提取的方法：傳統(tǒng)的酚CHCl?抽提法和柱式抽提法。

操作流程概要

酚CHCl?抽提法

以 Vazyme 產(chǎn)品 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme #R401) 為例

自備材料

CHCl?，異丙醇，75% 乙醇 (DEPC 水配制 )，DEPC 水

組分

                                                                                                                                                                                                         

樣本制備（過多的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致樣本裂解不充分，并使產(chǎn)物純度降低；）

1ml RNA is olater 能夠充分裂解的最大樣本量如下：                                                                                                                                                                                                                                                                  

貼壁細(xì)胞（對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞）

1.棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌一次。

2.每 10 cm2 培養(yǎng)面積的細(xì)胞加入 1-3 ml RNA isolater，使之充分覆蓋到細(xì)胞表面，

然后用移液器將細(xì)胞吹打下來。

3.將裂解液轉(zhuǎn)移至 1.5 ml 離心管中，用移液器反復(fù)吹打直至無明顯顆粒樣存在。

冰上靜置 5 min

懸浮細(xì)胞

1、離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌一次。

2、每 5 ⅹ 106 -107 個(gè)細(xì)胞加入 1 ml RNA isolater。

3、用移液器反復(fù)吹打直至無明顯顆粒樣存在。冰上靜置 5 min。

動(dòng)物組織

液氮研磨（部分研磨會(huì)影響 RNA 的得率和質(zhì)量）：

1、將液氮研磨的粉末立即轉(zhuǎn)移至離心管中，加入 RNA isolater 裂解液，靜置。待樣品全部融化后，再繼續(xù)吹打至裂解液透明。

2、將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12,000 × g 4℃離心 5 min，吸取上清。

勻漿處理：

1、可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在 RNA isolater 裂解液中，用電動(dòng)勻漿器高速勻漿，將組織全部研磨均勻。

2、將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12,000 × g 4℃離心 5 min，吸取上清。

提取流程        
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   

柱式抽提法

以 Vazyme 產(chǎn)品 FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme #RC101/RC111) 為例

自備材料

組分

β- 巰基乙醇、無水乙醇、RNase-free 槍頭等。

培養(yǎng)細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：

無需消化，可直接使用 Buffer RL1( 已加入 β- 巰基乙醇 ) 進(jìn)行消化、裂解；或用胰酶消化后離心收集細(xì)胞加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巰基乙醇 )，每 2-5×106 個(gè)細(xì)胞加入 500 μl Buffer RL1。用移液器反復(fù)吹打混勻直至看不到細(xì)胞團(tuán)塊。（使用前在 Buffer RL1 加入 β- 巰基乙醇至終濃度為 1%（如1 ml Buffer RL1 中加入 10 μl β- 巰基乙醇），盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）

懸浮細(xì)胞：

直接離心收集細(xì)胞，加入 Buffer RL1( 已加入 β- 巰基乙醇 )，每 2-5×106 個(gè)細(xì)胞加入 500 μl Buffer RL1，用移液器反復(fù)吹打混勻直至看不見細(xì)胞團(tuán)塊。（每 2-5×106 個(gè)細(xì)胞加入 500 μl Buffer RL1，細(xì)胞裂解完后若不立即進(jìn)行下一步操作，可以置于 -70℃、保存）

提取流程

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