分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--二、TOPO克隆

常見問題分析：

不長克隆

1. 片段類型錯(cuò)誤：只兼容 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，且引物 5’端不可磷酸化修飾；
2. 片段投入不符合要求：片段應(yīng)當(dāng)切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時(shí)需稀釋使用，保證體系各組分投入體積不小于 1μl；片段投入量應(yīng)按照說明書公式計(jì)算；
3. 連接反應(yīng)不適當(dāng)：反應(yīng)應(yīng)在 PCR 儀中進(jìn)行，溫度可設(shè)置 25 或 37°C，連接時(shí)間可從 5min延長至 30min。

空載體 / 假陽性
1. PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系，提高特異性；對(duì)目的片段切膠回收；鑒定更多單克?。?br role="presentation" style="padding: 0px; margin: 0px; color: transparent; position: absolute; white-space: pre; cursor: text; transform-origin: 0% 0%;"/>2. 片段投入不符合要求：片段應(yīng)當(dāng)切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時(shí)需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；片段投入量應(yīng)按照說明書公式計(jì)算；
3. 連接反應(yīng)不適當(dāng)：反應(yīng)應(yīng)在 PCR 儀中進(jìn)行，溫度可設(shè)置 25 或 37°C，連接時(shí)間可從 5min延長至 30min；
4. 菌液 PCR 用酶不適合：PCR 酶活應(yīng)當(dāng)不受雜質(zhì)影響，引物不應(yīng)選擇插入片段 PCR 用引物進(jìn)行檢測。

測序突變
1. 測序克隆數(shù)過少：測序單克隆數(shù)只有 1 個(gè)時(shí)，測序信息部分可信，建議多測幾個(gè)單克隆，檢查突變處的測序信號(hào)是否有問題，突變是否從模板引入；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實(shí)驗(yàn)；位于其他部位的突變，應(yīng)當(dāng)使用高保真酶重新制備模板再次實(shí)驗(yàn)。

測序片段不正確
1. PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系，提高特異性；對(duì)目的片段切膠回收；鑒定更多單克??；

2. 模板存在 Amp/kana 抗性的質(zhì)粒：對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收。

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