聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

簡(jiǎn)介

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。PCR的發(fā)明者凱利·穆利斯（Kary.B.Mullis）于1993年與邁克爾·史密斯分享了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR反應(yīng)過(guò)程

聚合酶鏈反應(yīng)是在一個(gè)反應(yīng)混合物中進(jìn)行的，該反應(yīng)混合物包括DNA提取(模板DNA)、Taq聚合酶、引物，以及在緩沖溶液中過(guò)量的四種脫氧核糖核酸苷三磷酸鹽(dNTPs)。PCR的三步驟為變性---退火---延伸。

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

臨床應(yīng)用

PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。一般實(shí)驗(yàn)室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測(cè)方法一般需要10⁵-⁷個(gè)病原體才可檢測(cè)到。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期"問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。此次武漢新型肺炎中“核酸檢測(cè)"所使用到的就是基于PCR法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)。

在許多腫瘤早期和良性的階段，癌基因的表達(dá)改變以及突變就已經(jīng)出現(xiàn)，PCR技術(shù)不但能有效的檢測(cè)基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。而在腫瘤的個(gè)體化用藥中，《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》中提到的幾大類檢測(cè)方法中，如Sanger測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法、NGS、ARMS-PCR法、HRM法，數(shù)字PCR法，熒光定量PCR法都是基于PCR法發(fā)展的新型技術(shù)。

在遺傳病方面，PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和β-地中海貧血的基因突變開(kāi)始的。

PCR是一種現(xiàn)在在細(xì)胞和分子生物學(xué)中使用普遍的技術(shù)。它允許，特別是在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，通過(guò)自動(dòng)化系統(tǒng)“非細(xì)胞克隆"DNA片段，這通常需要幾天的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的分子克隆。另一方面，PCR被廣泛用于診斷目的，以檢測(cè)特定的DNA序列的存在這個(gè)或那個(gè)生物體在生物液體。它還被用來(lái)制作遺傳指紋，無(wú)論是在司法調(diào)查中對(duì)一個(gè)人的遺傳鑒定，還是對(duì)動(dòng)物品種、植物或微生物進(jìn)行食品質(zhì)量檢測(cè)、診斷或品種選擇的鑒定。PCR仍然是進(jìn)行測(cè)序或定點(diǎn)突變所必需的。另外還有一些關(guān)于PCR技術(shù)改良的報(bào)道例如金屬有機(jī)框架輔助的高效聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

PCR變體

最后簡(jiǎn)單介紹一下PCR的變體，如real-time PCR, competitive PCR, PCR in - situ, RT-PCR等。

遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環(huán)溫度逐漸下降。

逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA為模板，也因?yàn)槭菑谋憩F(xiàn)型基因來(lái)進(jìn)行增量的，由此產(chǎn)生出來(lái)的cDNA產(chǎn)物不帶有內(nèi)含子（基因中不具意義的段落），常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。

熱啟動(dòng)PCR（hot start PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，減少非專一性產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）：PCR過(guò)程中利用螢光探針或染料定量檢測(cè)，又稱定量PCR（quantitative PCR），可以進(jìn)行多組對(duì)比。此次武漢新型肺炎中“核酸檢測(cè)"所使用到的關(guān)鍵技術(shù)

巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴(kuò)增。

多重PCR（multiplex PCR）：在同一個(gè)管中使用多組引物。

復(fù)原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR產(chǎn)物稀釋10倍后重新放入原濃度的引物和dNTP等循環(huán)3次，以消除產(chǎn)物中的異二聚體。

dsRNA合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股DNA轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的雙股RNA（dsRNA）?？蓱?yīng)用于RNAi實(shí)驗(yàn)操作。

COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以檢測(cè)突變或特殊等位基因的PCR應(yīng)用技術(shù)。

Digital-PCR：將標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)分割至每一個(gè)反應(yīng)中僅1~2個(gè)copy。藉以偵測(cè)微小比例的基因差異。應(yīng)用于：病原體檢測(cè)、癌癥突變基因、借由母血對(duì)胎兒做產(chǎn)前檢測(cè)。

產(chǎn)品推薦

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