Western blot之蛋白轉(zhuǎn)印二三事

蛋白轉(zhuǎn)印的方法

      蛋白轉(zhuǎn)印可選擇傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)或快速半干轉(zhuǎn)方法。濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)：適用于大多數(shù)各種分子量的常規(guī)蛋白轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印過程中凝膠和膜被浸入充滿轉(zhuǎn)印緩沖液的槽中。半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)：凝膠和膜被夾在預(yù)先潤(rùn)濕緩沖液的濾紙之間，濾紙與平板電極直接接觸。半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)的安裝使用比濕轉(zhuǎn)簡(jiǎn)單?？焖俎D(zhuǎn)印系統(tǒng)：快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)是最近發(fā)展出來的技術(shù)，使用專用設(shè)備、專用濾紙及專用緩沖液來快速有效地轉(zhuǎn)印蛋白。通常濾紙和濕潤(rùn)的膜預(yù)先放在一次性包裝中，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)印“三明治"的組裝。

轉(zhuǎn)印緩沖液

       轉(zhuǎn)印緩沖液包含強(qiáng)導(dǎo)電性化學(xué)緩沖試劑（例如Tris，CAPS或碳酸鹽），以便在轉(zhuǎn)印過程中保持系統(tǒng)的電導(dǎo)率和pH值。另外，轉(zhuǎn)印緩沖液中也有可能含醇（甲醇或乙醇）以促進(jìn)蛋白與膜的結(jié)合，同時(shí)也可以添加SDS促進(jìn)蛋白從凝膠中洗脫。

      SDS和醇：SDS和醇在轉(zhuǎn)移中起相反的作用。SDS可以促進(jìn)蛋白質(zhì)從凝膠中洗脫，如果某些蛋白質(zhì)難以從凝膠中洗脫，則可以將SDS添加到轉(zhuǎn)印緩沖液中。但是，轉(zhuǎn)印緩沖液中的SDS會(huì)降低蛋白質(zhì)與硝酸纖維素膜的結(jié)合效率；如果需要，可以使用PVDF膜作為替代。醇可從SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中除去SDS，并改善蛋白質(zhì)與硝酸纖維素膜的結(jié)合。但是醇會(huì)導(dǎo)致凝膠孔徑減小，影響蛋白遷移；還會(huì)導(dǎo)致某些蛋白或堿性蛋白沉淀，還會(huì)使堿性蛋白帶正電荷或處于中性狀態(tài)。

         轉(zhuǎn)印緩沖液技巧：1、請(qǐng)勿重復(fù)使用轉(zhuǎn)印緩沖液，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)印過程中緩沖液可能會(huì)失去保持穩(wěn)定pH的能力。2、不要稀釋轉(zhuǎn)印緩沖液；這也會(huì)減少緩沖能力。3、請(qǐng)勿調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移緩沖液的pH，因?yàn)檫@會(huì)增加緩沖液的電導(dǎo)率，產(chǎn)生較高的初始電流，降低電阻。

轉(zhuǎn)印膜的種類

      轉(zhuǎn)印膜有兩類：硝化纖維素膜（NC）和聚偏二氟乙烯 （PVDF）。

      硝化纖維素膜和增強(qiáng)型硝化纖維素膜：硝酸纖維素膜很容易在水或轉(zhuǎn)印緩沖液中潤(rùn)濕，并且與多種蛋白檢測(cè)方法兼容。無支持的硝化纖維素很脆，不建議用于抗體剝離及重孵育實(shí)驗(yàn)。增強(qiáng)型硝酸纖維素膜是含有惰性支撐結(jié)構(gòu)的硝酸纖維素膜。這種額外的支撐使膜具有更高的強(qiáng)度和彈性，可以用于抗體剝離及重孵育，并可承受高壓滅菌（121℃），依然保持硝酸纖維素的易潤(rùn)濕性。

      聚偏二氟乙烯 （PVDF）：PVDF 膜具有很強(qiáng)的蛋白結(jié)合能力（約為硝化纖維素的兩倍），并且在通常的處理中不易破裂，因此可以用于抗體的剝離和重孵育實(shí)驗(yàn)。低熒光背景的 PVDF 膜結(jié)合了 PVDF 的優(yōu)勢(shì)，并且在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有低自發(fā)熒光。在長(zhǎng)時(shí)間曝光情況下，不會(huì)增加背景熒光水平，有利于檢測(cè)微弱的熒光信號(hào)。

影響轉(zhuǎn)印條件的因素

      緩沖液組成：添加SDS或其他的酸、堿液會(huì)引起離子濃度變化，從而改變轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的電阻，進(jìn)而改變電流，并導(dǎo)致電流和電壓讀數(shù)以及轉(zhuǎn)印效率變化。

      凝膠數(shù)：電流隨著凝膠數(shù)量的增加而增加。需要考慮額外的冷卻或限制轉(zhuǎn)印時(shí)間。

      凝膠丙烯酰胺濃度：較高的丙烯酰胺百分比濃度會(huì)減慢蛋白在凝膠中的遷移。需考慮延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間。蛋白質(zhì)在低濃度丙烯酰胺凝膠中遷移速度快。應(yīng)考慮限制轉(zhuǎn)印時(shí)間，以防止小蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)過。

      緩沖液量：緩沖液增加時(shí)電流也會(huì)增加。需考慮額外的冷卻或限制轉(zhuǎn)印時(shí)間。

      轉(zhuǎn)印溫度：電流隨體系溫度升高而增加。

      蛋白分子量：大蛋白從凝膠中遷移的速度更慢?？紤]延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間或增加電壓。相反，小蛋白會(huì)快速遷移并可能穿透印跡膜?？紤]限制轉(zhuǎn)印時(shí)間或電壓。

轉(zhuǎn)印技巧

      1、去除氣泡：均勻的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印需要三明治的各組件之間*接觸，尤其是凝膠和膜*接觸。氣泡會(huì)導(dǎo)致膜上出現(xiàn)空白點(diǎn)，蛋白轉(zhuǎn)印時(shí)會(huì)在氣泡周圍“流動(dòng)"，因此請(qǐng)使用凝膠滾輪將這些氣泡趕出！提示：梯度凝膠最好上下滾動(dòng)，而不是左右滾動(dòng)。左右滾動(dòng)會(huì)導(dǎo)致梯度凝膠翹曲和起皺。

      2、轉(zhuǎn)印前的預(yù)平衡：濕轉(zhuǎn)和傳統(tǒng)半干轉(zhuǎn)時(shí)，將凝膠電泳緩沖液替換為轉(zhuǎn)印緩沖液可獲得更好的轉(zhuǎn)印效果。電泳緩沖液的帶入會(huì)增加電導(dǎo)率，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)印過程中產(chǎn)生過多的熱量?？稍谒卸虝簺_洗凝膠，然后在轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡凝膠15分鐘，平衡膜5分鐘。請(qǐng)注意，對(duì)于某些快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，不建議使用凝膠預(yù)平衡，請(qǐng)遵循制造商的操作指南。

     3、防止膜變干：在轉(zhuǎn)印之前和之后均需保證膜的濕潤(rùn)，從轉(zhuǎn)印三明治中取出后，轉(zhuǎn)印熱量會(huì)使膜容易變干燥。對(duì)于PVDF膜尤其重要，因?yàn)镻VDF膜是疏水的。應(yīng)迅速將膜浸入預(yù)先準(zhǔn)備好的緩沖液中，以免膜干燥。如果干了，可將硝酸纖維素膜重新在緩沖液中浸濕，而PVDF膜則需要在醇中重新活化。