關(guān)于PCR，你知道多少？ ----幾種特殊的PCR

1、錨定PCR（anchored PCR） 

通常采用的PCR反應(yīng)必須知道欲擴(kuò)增的DNA或RNA片段兩側(cè)的序列，而在大多數(shù)情況下對(duì)某些序列本身或其旁側(cè)序列并不清楚，“錨定PCR"可以幫助克服序列未知或序列*未知帶來(lái)的障礙。

基本做法是：分離細(xì)胞總RNA或者mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3’末端加上poly（dG）尾巴。與此poly（dG）相對(duì)應(yīng)的錨定引物poly（dC）為保證擴(kuò)增特異性，建議此段旁聚（dC）在十二聚以上，5’端可帶上某些限制酶序列或其他序列信息。在與基因特異配對(duì)的引物參與下，可以擴(kuò)增出此帶同源多聚物尾巴的cDNA序列。

2、不對(duì)稱PCR（asymmetric PCR） 

典型的PCR反應(yīng)產(chǎn)生一種特定的雙鏈DNA拷貝，不對(duì)稱PCR可以利用引物濃度的差別，形成單鏈DNA，便于測(cè)序。一般采用50～100：1比例的引物濃度，在最初的10～15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M時(shí)，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA，分離此擴(kuò)增產(chǎn)物中的ssDNA可用原引物或第三條內(nèi)部引物直接測(cè)序。

3、反向PCR（inverse PCR） 

PCR反應(yīng)允許擴(kuò)的DNA片段位于已知序列的兩個(gè)引物之間。反向PCR的應(yīng)用則可以對(duì)一個(gè)已知的DNA片段的兩側(cè)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有的限制性內(nèi)切酶對(duì)此段DNA進(jìn)行酶切，連接成環(huán)狀DNA分子，選擇合適方向和已知序列兩末端互補(bǔ)的引物，經(jīng)PCR后，可以得到未知序列的DNA片段，用此方法可建立基因組步移文庫(kù)。

4、多重PCR（multiplex PCR） 

PCR技術(shù)的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域是檢測(cè)特定序列的存在或缺失。如果待檢測(cè)的基因片段存在，經(jīng)PCR可以產(chǎn)生擴(kuò)增區(qū)帶，如果缺失則沒(méi)有擴(kuò)增帶出現(xiàn)。在許多情況下需要檢測(cè)的基因十分龐大，有的可達(dá)數(shù)百上千kb。對(duì)此有人提出了多重PCR，即在同一個(gè)試管中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)段。如果某一區(qū)段缺失則在相應(yīng)的電泳圖譜上這一區(qū)帶就會(huì)消失。多重PCR和southern blotting 一樣可靠，但要簡(jiǎn)便的多。

5、著色互補(bǔ)PCR（color complementation assay） 

著色互補(bǔ)PCR又稱熒光PCR，可用于區(qū)分長(zhǎng)短相近的多種基因成分。其原理是用不同的熒光染料，如紅色的羅丹明（POX）和綠色的熒光素（FAM）等分別標(biāo)記于不同的寡核苷酸引物上，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA區(qū)段，反應(yīng)完畢后，利用分子篩除去延伸的引物。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色，據(jù)此可以很快診斷出是否某種基因缺失，或者發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒。