如何通過化學(xué)修飾提高mRNA的穩(wěn)定性和效率？

德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

從感染性疾病到癌癥再到各種罕見疾病，mRNA在各種疾病中都顯示出潛在的治療價(jià)值。

然而，mRNA分子不穩(wěn)定，易降解，通常需要對mRNA天然堿基進(jìn)行修飾，如capping, tail, modification和replace。

例如，兩種正式推出的病毒mRNA疫苗的mRNA分子都進(jìn)行了不同程度的特殊修飾。

這些特殊修改的效果如何?這也是科學(xué)家需要深入研究和解決的問題。準(zhǔn)確定量的鑒定mRNA的修飾位點(diǎn)和修飾方法是深入分析mRNA修飾功能和機(jī)制的前提，也為提高mRNA的穩(wěn)定性和效率提供了新的方向。

德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)在mRNA轉(zhuǎn)錄過程中引入了第三個(gè)堿基對，將非自然的核苷酸引入到特定的位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合自然的mRNA修飾方法。

研究發(fā)現(xiàn)，雙化學(xué)修飾的mRNA可以形成協(xié)同效應(yīng)，提高mRNA的穩(wěn)定性、效率和蛋白表達(dá)。

本團(tuán)隊(duì)利用該方法對mRNA進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)一步研究了人工修飾核苷酸對mRNA效率和穩(wěn)定性的影響。

“我們研究了這種化學(xué)修飾的mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，合成的mRNA是否可以用作細(xì)胞中高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)的模板，以及化學(xué)修飾對翻譯成蛋白質(zhì)的影響"，肖爾教授說:“研究結(jié)果表明，這種新方法在監(jiān)測mRNA進(jìn)入細(xì)胞、監(jiān)測和影響其在細(xì)胞水平的傳播以及信息轉(zhuǎn)錄的效率方面非常有效。"

該研究成果已被《Chemical Science》雜志接受。

這項(xiàng)研究是由科隆大學(xué)有機(jī)化學(xué)研究所的斯蒂芬妮·卡特-肖爾教授領(lǐng)導(dǎo)的，她從2020年開始在科隆大學(xué)化學(xué)系擔(dān)任教授。

實(shí)驗(yàn)室主要研究方向?yàn)楹怂峄瘜W(xué)和化學(xué)生物學(xué)，包括功能RNA-核酸化學(xué)修飾、催化RNA和非編碼RNA功能研究。

根據(jù)研究小組的說法，這種方法有望為開發(fā)更有效的mRNA療法開辟新的可能性。

雙化學(xué)改性，達(dá)到協(xié)同增效

目前，有多種修飾技術(shù)可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的mRNA，大致可分為三類：用人工合成的非天然核糖核酸代替天然核糖核酸合成mRNA；添加5′caps、3′poly（A）“尾"和UTR（未翻譯區(qū)）序列；并采用特殊的新型配方技術(shù)，有效保護(hù)mRNA。

其中，人工合成非天然核糖核酸取代天然核糖核酸合成mRNA是較為常用的方法之一。真核mRNA上的化學(xué)修飾大致可以分為三類:甲基化、偽尿苷(Ψ)和次嘌呤。

經(jīng)過研究和工業(yè)應(yīng)用，該方法可以降低mRNA固有的免疫原性和不穩(wěn)定性。例如，Moderna和BioNTech的mRNA疫苗都使用偽尿嘧啶修飾來維持mRNA的穩(wěn)定性。

隨著mRNA治療的不斷發(fā)展，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界一直在尋找更多的改進(jìn)方法，以提高mRNA的效率和穩(wěn)定性。深入分析這些修飾對mRNA的功能影響，是控制mRNA結(jié)構(gòu)、提高其穩(wěn)定性和翻譯活性的重要基礎(chǔ)。

為了進(jìn)一步研究這些化學(xué)修飾對mRNA的影響，Stephanie kat - schorr的團(tuán)隊(duì)提出了結(jié)合位點(diǎn)特異性插入合成核苷酸和自然堿基修飾的想法。

在他們的實(shí)驗(yàn)中，通過在DNA到RNA的酶轉(zhuǎn)錄過程中引入第三個(gè)堿基對，他們在3 ' -UTR處插入了合成的核苷酸，包含了Ψ和5mC(甲基化修飾)。，并設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)來觀察、量化和驗(yàn)證mRNA的功能。

重要的是要注意,引入合成核苷酸通過基因轉(zhuǎn)錄(GENAEXT)字母擴(kuò)張建立在以前的工作由各自的團(tuán)隊(duì)一郎Hirao弗洛伊德Romesberg,他在2018年發(fā)表的研究指出,不自然的堿基對可以轉(zhuǎn)錄精度高、效率高。

在此基礎(chǔ)上，通過將功能化的非自然核苷酸具體引入長mRNA片段進(jìn)行了改進(jìn)。

在這項(xiàng)研究中，科隆大學(xué)團(tuán)隊(duì)在體外合成了功能化和編碼蛋白質(zhì)的GENAEXT mRNA，其中包括CP修飾，可以編碼紅色熒光報(bào)告蛋白mCherry。

具體包括在3 ' -UTR區(qū)域插入環(huán)丙烯(CP)， mRNA上Ψ和5mC修飾以提高其活性，以及引入5 ' cap和3 ' tail修飾。

然后，將修飾后的mRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA水平和mCherry報(bào)告基因的表達(dá)，并與cp修飾的GENAEXT mRNA與未修飾的mRNA的翻譯效率進(jìn)行比較。

數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過雙重化學(xué)修飾方法(自然堿基修飾和CP非自然堿基對插入)的mRNA在細(xì)胞內(nèi)翻譯可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，這種合成的mRNA可以增加蛋白表達(dá)，提高轉(zhuǎn)染效率、有效性。

此外，cp修飾的mRNA在活細(xì)胞中通過反電子需求Diels-Alder (iEDDA)反應(yīng)進(jìn)行熒光標(biāo)記。

用四嗪熒光團(tuán)衍生物對合成的mRNA進(jìn)行iEDDA處理后，研究人員可以通過共聚焦熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞中的mRNA，同時(shí)也可以在時(shí)間和空間上跟蹤mRNA。

iEDDA:一種無催化劑的點(diǎn)擊反應(yīng)(環(huán)加成反應(yīng))，具有生物相容性好、反應(yīng)特異性高、反應(yīng)速度快、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。

為了評估mRNA轉(zhuǎn)染過程中的細(xì)胞狀態(tài)和活細(xì)胞中的click反應(yīng)，他們還進(jìn)行了細(xì)胞活力測定。

釋放更多的mRNA潛能?

事實(shí)上，從mRNA序列進(jìn)入細(xì)胞到引導(dǎo)細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的過程存在許多困難，包括在進(jìn)入細(xì)胞之前被無處不在的RNAse水解成小核苷酸分子;穩(wěn)定表達(dá),等等。

如前所述，利用人工合成的非天然核苷酸取代天然核苷酸合成mRNA已經(jīng)是常用的mRNA修飾方法之一。

同時(shí)，通過在特定的mRNA片段中引入人工合成的非天然核苷酸，證明了修飾mRNA的可行性。在本研究中，該團(tuán)隊(duì)將這兩種方法結(jié)合起來，提高了蛋白質(zhì)合成效率和轉(zhuǎn)染效率。

因此，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GENAEXT方法的使用將為mRNA修飾的研究提供新的思路。

“這種方法可能為mRNA修飾開辟新的可能性微調(diào)mRNA的特性，并通過共價(jià)載體系統(tǒng)將mRNA高效傳遞到細(xì)胞中，"該團(tuán)隊(duì)指出，他們已經(jīng)通過一系列的研究表明，原則上，GENAEXT方法可以應(yīng)用于任何長度的mRNA序列，而與四嗪衍生物的iEDDA click反應(yīng)將使mRNA更功能化。

此外，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，通過在mRNA的非翻譯區(qū)引入人工調(diào)節(jié)元件，調(diào)控mRNA翻譯水平的潛力可能被解鎖。

同時(shí)，他們提到，該方法除了能夠在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中附著各種報(bào)告基團(tuán)外，還具有應(yīng)用于體外蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以鑒定mRNA結(jié)合蛋白的潛力。

此外，該團(tuán)隊(duì)提出的方法還將為檢測修飾后mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)效率提供一個(gè)新的“把柄"。目前，科學(xué)家們已經(jīng)在定量和高通量兩個(gè)方向開發(fā)了多種方法。

更常用的方法包括通過結(jié)合特異性抗體的高通量富集，化學(xué)小分子/化學(xué)小分子衍生物的富集，以及特殊性質(zhì)。測序技術(shù)。

對于下一個(gè)計(jì)劃，研究小組表示，他們正在開發(fā)更有效地包裝mRNA的方法，以更好地保護(hù)mRNA，使其順利進(jìn)入細(xì)胞。