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上皮細胞類培養(yǎng)實驗

時間:2023/6/6閱讀:773
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實驗原理:

利于皮膚表皮細胞實驗">培養(yǎng)成功的因素有,在有膠原的底物上易生長;另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3 細胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)上時,細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等,均利于表皮細胞生長。向培養(yǎng)基中加氫化可的松( 10 μg/ml )、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素(Isopro-terenol)和10 ng/mI 促表皮生長因子(EGF)能促表皮細胞生長。


方法:

皮膚是皮表細胞培養(yǎng)來源,小兒包皮是皮膚表皮細胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時,表皮細胞與成纖維細胞混合生長,難以純化。黑木登志夫(1981)用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲純上皮細胞,有一定參考價值,其法如下:

 

1.  取材

取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮
膚更好,切成 0.5~1 平方厘米小塊;

2.  EDTA處理

先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘;

3.  冷消化

換入0.25 %胰蛋白酶中,置4 ℃過夜;

4.  分離

取出皮塊,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開;

5.  溫消化

取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25 %胰蛋
白酶中,37 ℃再消化30~60 分鐘;

6.  用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液;

7.  培養(yǎng)液

通過80 目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和 20 %小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2溫箱培養(yǎng)。


注意事項:

冷消化目的在于使表皮和真皮結合松散,如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散,此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液;不再經過第二次消化。


其他:

皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好,它對結締組織有較強消化作用,對表皮細胞損傷小,但成纖維細胞易與上皮細胞同時生長,在這種情況下,需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子(PDGF),易促成纖維細胞的生長;如用好的、不含PDGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。


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