體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞一樣，不僅需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更需要一個(gè)穩(wěn)定的生活環(huán)境，如溫度、CO2濃度、濕度等，二氧化碳培養(yǎng)箱則是不錯(cuò)選擇。二氧化碳培養(yǎng)箱是在普通培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過(guò)在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個(gè)類似細(xì)胞在生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，如合適的溫度（37°C）、恒定的CO2水平（常用5%）、穩(wěn)定的酸堿度（pH值：7.2-7.4）、較高的相對(duì)飽和濕度（常用95%），來(lái)對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。其用途甚廣，主要用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞、組織和某些特殊微生物，為它們提供一個(gè)良好的體外環(huán)境，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、組織學(xué)實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。因此，CO2培養(yǎng)箱的消毒和維護(hù)尤為重要。

　　1、二氧化碳培養(yǎng)箱的污染

　　凡混入CO2培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)中，對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。細(xì)胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞分化變形，較重的細(xì)胞增殖停止，從瓶壁脫落，甚至死亡。不同的污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別，有的影響是長(zhǎng)期、緩慢和潛在的，而有的則能在很短的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺毒細(xì)胞。根據(jù)污染源不同主要可以分為：生物性污染、化學(xué)性污染、物理性污染和氣溶膠污染。

　　1.1 生物性污染：這是最常見(jiàn)也是危害最大的污染。如細(xì)菌、病毒、真菌，支原體等。這些污染源有可能是人為帶入，或是細(xì)胞在放入培養(yǎng)箱前已經(jīng)受污染，再或者是箱體本身沒(méi)有消毒干凈。體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而培養(yǎng)基中所加抗生素的抗微生物污染的能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無(wú)法挽救的。

　　1.2 化學(xué)性污染：培養(yǎng)箱中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞污染。如細(xì)胞培養(yǎng)容器清洗過(guò)程中殘留的洗滌劑、加濕器中未純化的水、人為帶入的液體或氣體都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞污染是不一樣的，有的可能促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，有的甚至殺死細(xì)胞。

　　1.3 物理性污染：培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染，其主要是在代謝水平或分子水平上，影響細(xì)胞正常的生理過(guò)程。

　　1.4 氣溶膠污染：氣溶膠是液體或固體微粒均勻地懸浮在氣體介質(zhì)中的分散體系，當(dāng)微粒是微生物時(shí)，就是微生物氣溶膠，如果這種微生物是病原性的，就是病原微生物氣溶膠。細(xì)菌、病毒等病原體通過(guò)氣溶膠可在人與人、人與環(huán)境之間傳播。微生物氣溶膠可分為兩大類：一類是飛沫核氣溶膠，另一類是粉塵氣溶膠。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)許多操作都可以產(chǎn)生氣溶膠，并且大多可能是病原微生物形成的感染性氣溶膠，由于其氣溶膠分子小，漂浮在空氣中、粘附于人身上，易在空氣中擴(kuò)散而污染實(shí)驗(yàn)室的空氣。

　　2、CO2培養(yǎng)箱污染防控措施

　　2.1 CO2培養(yǎng)箱的選擇：二氧化碳培養(yǎng)箱的制造商們?cè)O(shè)計(jì)了多種不同的裝置去減少和防止污染的發(fā)生，其主要是防污染設(shè)計(jì)和消毒滅菌系統(tǒng)的改進(jìn)，以達(dá)到消毒滅菌的目的。如帶有紫外消毒功能的CO2培養(yǎng)箱、帶HEPA過(guò)濾器的CO2培養(yǎng)箱，以及帶高溫消毒的CO2培養(yǎng)箱等，后者又分為高溫干熱和高溫濕熱兩類。這些裝置的滅菌能力各有千秋，紫外燈消毒范圍有限，距離燈越遠(yuǎn)，消毒能力越差。HEPA過(guò)濾器的過(guò)濾膜孔徑有限，無(wú)法去除病毒和一些微小細(xì)菌，并且容易損耗，也有其局限性。相比而言，高溫消毒則是比較有效的方法。而高溫干熱和高溫濕熱也有所不同，由于蒸汽潛熱大、穿透力強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，因此高溫濕熱的滅菌效率比干熱滅菌法高。

　　2.2 提高素質(zhì)：人為因素和態(tài)度可以對(duì)環(huán)境、人和物起到一個(gè)正面或負(fù)面的影響。以安全為目的，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的工作人員應(yīng)明白自身的態(tài)度和人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的重要性。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，特別是進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前的培訓(xùn)，并且定期進(jìn)行考核檢查是十分必要的。

　　2.3 重視管理： 細(xì)胞室內(nèi)的培養(yǎng)箱應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理，定期對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校正，至少每年一次。各項(xiàng)數(shù)值一旦固定后，不要隨意調(diào)節(jié)，以免影響箱內(nèi)溫度、濕度、CO2濃度的波動(dòng)，降低機(jī)器的靈敏度，同時(shí)還會(huì)影響培養(yǎng)箱內(nèi)的細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)。使用前，對(duì)培養(yǎng)箱的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)校正，并且對(duì)箱體和內(nèi)部進(jìn)行消毒處理，等各項(xiàng)數(shù)值穩(wěn)定一段時(shí)間后方可使用。一旦出現(xiàn)緊急問(wèn)題，應(yīng)及時(shí)上報(bào)，應(yīng)由專業(yè)的人員進(jìn)行操作，馬上采取應(yīng)對(duì)措施，以免造成不必要的損失。

　　2.4 規(guī)范操作：培養(yǎng)箱的使用雖然很簡(jiǎn)單，但同樣需要規(guī)范操作。進(jìn)細(xì)胞室必須穿著實(shí)驗(yàn)服（白大褂），換上拖鞋或者穿一次性的鞋套。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)必須帶一次性手套，特別是打開(kāi)培養(yǎng)箱前，必須先用75%的酒精噴壺噴洗雙手再開(kāi)培養(yǎng)箱，再取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。顯微鏡下查看細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板后，再放回培養(yǎng)箱時(shí)，同樣也要噴酒精消毒。培養(yǎng)箱的兩個(gè)門(mén)開(kāi)關(guān)取（放）物要迅速，不可長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)著，否則會(huì)影響CO2的濃度、溫度和濕度，以及造成污染。尤其是不要忘了關(guān)好里層的玻璃門(mén)。切記開(kāi)門(mén)時(shí)不要對(duì)著培養(yǎng)箱說(shuō)活，大口呼吸甚至是打噴嚏。

　　2.5 加強(qiáng)防護(hù)：如果實(shí)驗(yàn)人員生病而攜帶病菌，應(yīng)帶上口罩再進(jìn)細(xì)胞室，病情嚴(yán)重的則不宜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。女性同志實(shí)驗(yàn)時(shí)頭發(fā)應(yīng)梳起，防止皮屑污染及連帶事件的發(fā)生。如果實(shí)驗(yàn)室條件允許，可以每人佩戴實(shí)驗(yàn)帽、手套和口罩，以防污染培養(yǎng)箱及對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的自身的防護(hù)。

　　2.6 注重保養(yǎng)：二氧化碳培養(yǎng)箱置于細(xì)胞室中，室內(nèi)需保持干燥，環(huán)境溫度不能超過(guò)30℃（建議：18℃-30℃）。培養(yǎng)箱放置在遠(yuǎn)離門(mén)窗、供暖設(shè)備和空調(diào)導(dǎo)管的地方，不能被陽(yáng)光直接照射。培養(yǎng)箱的放置臺(tái)面必須水平避震且非易燃材質(zhì)，不能靠在墻壁或類似的建筑物上，其后部接電處和墻壁至少保留30cm的空間。一旦放好不宜再移動(dòng)。

　　2.7 校正處理：二氧化碳培養(yǎng)箱在放好后，再對(duì)箱體和內(nèi)部進(jìn)行消毒處理，并且對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)校正，等各項(xiàng)數(shù)值穩(wěn)定一段時(shí)間后方可使用。因CO2氣體對(duì)于健康是有害的，因此細(xì)胞室需安裝足夠的通風(fēng)裝置?？諝庵械姆蹓m氣溶膠易造成培養(yǎng)箱的污染，需要一個(gè)流通的空氣環(huán)境。將培養(yǎng)箱的管理任務(wù)分派給有經(jīng)驗(yàn)的檢查人員是十分重要的。如長(zhǎng)期不使用二氧化碳時(shí)，應(yīng)將CO2開(kāi)關(guān)關(guān)閉，防止CO2調(diào)節(jié)器失靈。

　　3、清潔、消毒、滅菌處理

　　3.1 清潔：

　　清潔是指去除灰塵、污垢和有機(jī)污漬。清潔方法包括刷、吸、干擦、洗滌或用浸泡肥皂水或清潔劑的濕布拖擦。粉塵、污物以及有機(jī)物是微生物的棲身之所，并可能影響除污染劑（抗菌劑、化學(xué)殺菌劑以及消毒劑）的作用。必須先經(jīng)過(guò)清潔才能實(shí)現(xiàn)消毒和滅菌的目的，許多殺菌劑只對(duì)經(jīng)過(guò)清潔過(guò)的物品才具有殺菌活性。清潔時(shí)必須使用與以后使用的消毒劑或殺菌劑化學(xué)性質(zhì)上相容的試劑進(jìn)行清潔、消毒。

　　3.1.1清潔箱體表面：先拂去表面的灰塵，再用濕的海綿或軟布清洗，再用軟布擦干。如果有污物則用低濃度的清潔劑清洗，然后擦干。

　　3.1.2清洗箱體內(nèi)部：選擇合適的消毒劑。所有的物件和表面必須*清洗，然后用無(wú)菌水沖洗，再擦干或晾干。

　　3.1.3清洗玻璃門(mén)：清洗箱內(nèi)的玻璃門(mén)時(shí)使用的清潔劑和清洗培養(yǎng)箱內(nèi)部時(shí)使用的相同。然后用蒸餾水漂洗，從而清除殘留的清潔劑，最后用軟布把門(mén)擦干。

　　3.2 消毒和滅菌

　　消毒是指殺死微生物的物理或化學(xué)手段，但不一定殺死其孢子。滅菌是指殺死所有微生物，當(dāng)培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞受到污染時(shí)則需要采取滅菌措施。一般，在培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞沒(méi)有污染的情況下平均1-3個(gè)月*消毒一次。二氧化碳的3種消毒滅菌的方式是：液體消毒劑、紫外和加熱。

　　3.2.1 液體消毒劑：選擇對(duì)培養(yǎng)箱無(wú)腐蝕性的液體消毒劑，并且液體消毒劑的消毒效果好壞和很多因素有關(guān)。比如：場(chǎng)所的溫度、接觸時(shí)間、pH、穿透能力、有機(jī)物的反應(yīng)。這些因素中的一些很小的變化可能會(huì)造成去污劑的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情況下，當(dāng)最終要求必須無(wú)菌時(shí)，液體去污劑也不是*可信賴的去污方法。

　　3.2.2 紫外消毒：一般先用蒸餾水清洗干凈后，再用紫外燈照射(帶紫外燈的培養(yǎng)箱)一天或者用手提式的紫外燈照射。

　　3.2.3 加熱：濕熱和干熱被認(rèn)為是殺菌有效的方法。在一般環(huán)境下，高壓滅菌器加熱到121℃快速產(chǎn)生蒸汽是常用的方法。干熱160℃-170℃，2-4小時(shí)在不具有滲透性、非有機(jī)體的物質(zhì)（如玻璃）是可行的凈化方法, 但是甚至在有機(jī)體或非有機(jī)體的淺層也不能被絕緣。

　　除了以上幾種方法外，還可以采用聯(lián)合殺菌的方法，幾種消毒滅菌的方法同時(shí)使用來(lái)達(dá)到*清潔的效果。

　　3.3 細(xì)胞室內(nèi)空氣的消毒

　　3.3.1 聯(lián)合消毒法：可以聯(lián)合使用液體和氣體消毒劑來(lái)清除實(shí)驗(yàn)室空間、用具和設(shè)備的污染。清除表面污染時(shí)可以使用次氯酸鈉溶液：濃度0.1％溶液用于普通的環(huán)境衛(wèi)生設(shè)備，而當(dāng)處理高危環(huán)境時(shí)，建議使用高濃度（0.5％）的溶液。在清除環(huán)境污染時(shí)，含有3％過(guò)氧化氫的溶液也可以作為漂白劑的代用品。

　　3.3.2 熏蒸法：通過(guò)加熱多聚甲醛或煮沸福爾馬林所產(chǎn)生的甲醛蒸汽熏蒸來(lái)清除房間和儀器的污染。這是一項(xiàng)需要由專門(mén)培訓(xùn)的專業(yè)人員來(lái)進(jìn)行的、非常危險(xiǎn)的操作。產(chǎn)生甲醛蒸汽前，房間的所有開(kāi)口（如門(mén)窗等）都應(yīng)用密封帶或類似物加以密封。熏蒸應(yīng)當(dāng)在室溫不低于21℃且相對(duì)濕度高于70％的條件下進(jìn)行。熏蒸法消毒時(shí)，氣體需要與物體表面接觸至少8小時(shí)，而熏蒸后，該區(qū)域必須*通風(fēng)后才能允許人員進(jìn)入。

　　3.4 消毒注意事項(xiàng)：

　　3.4.1 不要使用強(qiáng)堿和強(qiáng)腐蝕性的試劑以及含高含量次氯酸鈉的漂白劑和消毒劑，雖然不銹鋼有耐腐蝕性，但不是不受腐蝕。

　　3.4.2 避免在CO2傳感器上噴灑清洗劑，清洗之前要使傳感器充分冷卻。一般清洗用的水是蒸餾水或去離子水，不能用自來(lái)水。

　　3.4.3 揮發(fā)性的甲醛有毒，易燃、易爆。如果在培養(yǎng)箱內(nèi)殘留甲醛的話，會(huì)影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，甚至使細(xì)胞死亡。