為了最大限度地延長高效液相色譜柱的使用壽命并確保其最佳性能，有必要對色譜柱進行適當?shù)木S護。許多不同因素可能導致色譜柱分離度和靈敏度降低，但通常情況下，下列因素會導致絕大多數(shù)色譜柱出現(xiàn)性能問題。
1、污染物
通常，樣品中含有來源于樣品基質(zhì)的成分，這些成分可能會吸附于色譜柱之上。鹽、脂類、增塑劑和聚合物是在分析過程中可能與固定相接觸的成分。這些成分會損壞色譜柱和檢測器，并在分析過程中出現(xiàn)雜質(zhì)峰。如果這些雜質(zhì)成分不能被流動相洗脫，它們就會吸附在色譜柱上。隨著時間的推移，分析物會與這些雜質(zhì)產(chǎn)生相互作用，導致保留時間改變以及峰拖尾，從而影響分離。此外，這些雜質(zhì)的積累可能會造成色譜柱堵塞，導致色譜柱壓力升高、泵損壞、并導致色譜柱柱床塌陷，強烈建議使用保護柱來避免這類問題。保護柱是用與分析柱相同的填料填充的短柱，安裝在進樣器和分析柱之間。使用一段時間后，需要更換一個新的保護柱，以最大限度地延長分析柱的使用壽命。2、pH不穩(wěn)定
始終確保色譜柱在pH耐受范圍內(nèi)使用。請查閱色譜柱的使用說明書以確認該柱的pH范圍。當保存色譜柱時，應將色譜柱中的酸性或堿性緩沖鹽清洗干凈。3、高背壓
面多孔顆粒(SPP)的固定相與粒徑更小的全孔顆粒(FPP)相比，能在更低的背壓下提供更高的分離。藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范的要求是在盡可能低的壓力下運行分析方法，以最大限度的延長儀器和色譜柱的使用壽命。避免壓力沖擊也是很重要的。壓力沖擊是指壓力在短時間內(nèi)突然增加或減少。他們可能導致色譜柱柱床塌陷，并導致色譜圖峰分叉。所有2µm產(chǎn)品和1000? 2.7µm內(nèi)徑為2.1mm和3.0mm色譜柱耐壓1000bar。其余規(guī)格的色譜柱耐壓600bar。如下表所示：
顆粒大小
| 內(nèi)徑(mm) | 耐壓(bar)
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| 所有 | 0.75和0.1 | 600
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| 所有 | 0.2 – 0.5 | 400
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| 顆粒大小 | 內(nèi)徑(mm) | 耐壓(bar) |
| 所有 | 1.0 | 600
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2μm
| 2.1, 3.0 | 1000
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| 2.7µm 1000? (孔徑) | 2.1, 3.0 | 1000
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| 2.7µm | 2.1, 3.0, 4.6 | 600
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| 3.4 µm 400? (孔徑) | 2.1, 3.0, 4.6 | 600
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5μm
| 2.1, 3.0, 4.6 | 600
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注：“所有"表示所有可用的色譜柱規(guī)格型號
4、流動相質(zhì)量差
必須使用高質(zhì)量的溶劑(HPLC或MS級)作為流動相，并確保流動相的pH值在所使用的色譜柱的耐受pH范圍內(nèi)。請查閱色譜柱使用與維護指南。質(zhì)量差的溶劑中往往會含有雜質(zhì)，會吸附在色譜柱上，從而干擾分離。建議在使用前對流動相進行過濾，在分析過程中使用保護柱有助于除去流動相中的顆粒雜質(zhì)。
5、柱溫過高
為了最大限度的延長色譜柱的使用壽命，柱溫不宜超過色譜柱的最高可耐受溫度。可耐受溫度可以查閱色譜柱使用與維護指南。6、平衡時間不足
色譜柱的平衡時間取決于色譜柱規(guī)格。一般情況下，一根色譜柱可用20倍柱體積的溶劑平衡。請參照以下方程計算柱體積：①色譜柱體積(µL)= (1/4)(內(nèi)徑×2)(π)(柱長)(孔隙體積)1/4×4.41×3.14×100×0.50 =173µL =0.17mL當流速為0.4mL/min時，可以在8.5分鐘內(nèi)達到20倍柱體積。
關于色譜柱堵塞、污染和清洗的提示
1、壓力突然增加——所有鍵合相
一個高的壓力峰值或者明顯的急劇增加的柱壓，通常表明色譜柱被堵塞。為了清除堵塞物，可以嘗試反接色譜柱，不接檢測器，清洗20倍柱體積以去除色譜柱篩板上的顆粒或者污染物。——請注意：不建議反沖毛細柱或2µm HALO色譜柱。2、色譜柱清洗與再生
吸附累積的雜質(zhì)對色譜柱是有損壞的，但在某些情況下，這些雜質(zhì)可以被除去。下面將介紹如何能實現(xiàn)這一點。①所有非毛細柱和粒徑>2µm的色譜柱清洗（每項溶劑沖洗10倍柱體積）
C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl鍵合相為了從色譜柱上去除強殘留的物質(zhì)，使用非常強的溶劑(如正在使用的流動相的100%的有機成分)反向清洗色譜柱。如果需要使用更強的溶劑清洗，建議使用二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(95/5 v/v)。特殊情況下可能需要使用非常強的溶劑，如DMF或者DMSO。——請注意：不建議反沖毛細柱或2µm HALO色譜柱。
②所有顆粒的色譜柱再生（每項溶劑沖洗20倍柱體積）C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl鍵合相
如果前述的清洗程序無效，可以嘗試使用其他方法再生色譜柱。下面是反相色譜柱(RP)的再生程序。一般來說，再生的過程是相似的，其共同點是使用的清洗溶劑強度增加，并通常以非極性溶劑結(jié)束。至關重要的是，所使用的溶劑必須是能夠互溶的。步驟1-4通常足以清洗大多數(shù)的色譜柱，但是如果這還不夠，可以增加5和6。但是，在使用強非極性溶劑(如己烷)后，在重新平衡到初始溶劑體系之前用IPA清洗過渡是至關重要的，因為水與己烷不互溶。
HILIC和PENTA-HILIC鍵合相
1、HILIC色譜柱清洗
——請注意：不建議反沖毛細柱或2µm HALO色譜柱為了從色譜柱上去除強保留的物質(zhì)，使用50/50甲醇/水等強溶劑反相清洗色譜柱。特殊情況下，可能需要使用非常強的溶劑，如100%的流動相中的極性成分。另外，二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(95/5 v/v)通常非常有效。對于清洗后的HILIC色譜柱，需要先以70/30 ACN/H2O低流速沖洗2 – 3小時。
2、Penta-HILIC色譜柱清洗
為了從色譜柱上去除強保留的物質(zhì)，使用10/90甲醇/水等強溶劑反向清洗色譜柱。特殊情況下，可能需要使用非常強的溶劑，如100%的流動相中的極性成分，通常是水。
色譜柱保存(所有鍵合相)
1、長期保存
長時間保存(超過5天)硅膠基質(zhì)的色譜柱，建議使用100%乙腈。例外的是Biphenyl，它應該保存在100%甲醇中。使用含鹽流動相后，一定要用等比例不含鹽的流動相沖洗色譜柱除鹽，然后再用至少10倍柱體積的乙腈沖洗保存。
2、短期保存
短時間保存(低于5天)硅膠基質(zhì)的色譜柱，可將色譜柱保存在大部分常規(guī)使用的流動相中。使用含鹽流動相后，一定要用等比例不含鹽的流動相沖洗色譜柱除鹽，然后再保存。注意：每根色譜柱在使用之前，請仔細閱讀使用說明書！
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