對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，灌流工藝是指在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷向生物反應(yīng)器加入新的培養(yǎng)基，同時(shí)用細(xì)胞分離設(shè)備以相同速度將培養(yǎng)液和產(chǎn)物收獲，因此可以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不斷去除細(xì)胞碎片和副產(chǎn)物，降低細(xì)胞死亡后釋放的各種酶類(lèi)可能對(duì)產(chǎn)物的影響。同時(shí)由于連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基而提供一個(gè)較恒定的培養(yǎng)環(huán)境，因此可獲得較高的單位體積產(chǎn)率和細(xì)胞密度。灌流培養(yǎng)的顯著優(yōu)勢(shì)在于蛋白可以隨著收獲液及時(shí)地被分離出，蛋白在反應(yīng)器內(nèi)停留時(shí)間短，較少受到培養(yǎng)體系內(nèi)各種水解酶的降解作用，有利于蛋白質(zhì)量的提高。相比于補(bǔ)料批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)的高細(xì)胞密度、高細(xì)胞活率、高產(chǎn)量的特點(diǎn)使其能夠憑借小型生物反應(yīng)器規(guī)模達(dá)到補(bǔ)料批次培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)所得的蛋白量，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)規(guī)模小型化，一定程度上節(jié)約了成本，增加了操作的靈活度。

在灌流工藝中，通過(guò)移除耗竭的培養(yǎng)液并補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基從而實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的連續(xù)更新，而細(xì)胞被細(xì)胞分離設(shè)備截留在生物反應(yīng)器內(nèi)。

目前，用于灌流培養(yǎng)的細(xì)胞截留系統(tǒng)主要有以下幾種：基于中空纖維柱截留原理而設(shè)計(jì)的交替式切向流（Alternating Tangential Flow, ATF）系統(tǒng)中的中空纖維柱通過(guò)一根管道與反應(yīng)器相連，通過(guò)高壓空氣泵入與真空泵抽負(fù)壓的反復(fù)交替切換帶動(dòng)硅膠隔膜泵運(yùn)動(dòng)，使得細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)中空纖維柱進(jìn)出反應(yīng)器。

灌流工藝

BioSep是專(zhuān)為高密度灌流培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的細(xì)胞截留系統(tǒng)。應(yīng)用高頻共振超聲波分離細(xì)胞的方法，具備所有傳統(tǒng)分離設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，避免了傳統(tǒng)方法的固有問(wèn)題和局限性。BioSep基于聲學(xué)共振技術(shù)設(shè)計(jì)，是真正無(wú)污染無(wú)堵塞問(wèn)題的截留系統(tǒng)。BioSep可用于R&D的研究（1L/天），也可以用于過(guò)程開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)（1000L/天）。

切向流過(guò)濾（TFF）：在切向流過(guò)濾中，細(xì)胞液通過(guò)蠕動(dòng)泵作用形成一個(gè)連續(xù)的環(huán)形流動(dòng)方向，進(jìn)入纖維膜后，廢液會(huì)通過(guò)膜排出體系之外，細(xì)胞會(huì)隨著環(huán)路重新回到培養(yǎng)體系之內(nèi)。

實(shí)際操作灌流工藝時(shí)，補(bǔ)加到生物反應(yīng)器內(nèi)的新鮮料液（包括培養(yǎng)基、添加物、堿等）應(yīng)與從反應(yīng)器內(nèi)移除的培養(yǎng)液相當(dāng)，生物反應(yīng)器工作體積可使用天平進(jìn)行測(cè)量。

常用的灌流方法有以下幾種：

一：根據(jù)灌流速率，以設(shè)定的收獲速率泵出上清液，同時(shí)通過(guò)反饋控制自動(dòng)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)體積恒定。

二：新鮮培養(yǎng)基也可按設(shè)定的速率補(bǔ)加，而上清液根據(jù)培養(yǎng)液水平，自動(dòng)泵出。當(dāng)然在儀器故障時(shí)，前者可能導(dǎo)致生物反應(yīng)器工作體積減少以至排空，后者可導(dǎo)致生物反應(yīng)器溢出。當(dāng)發(fā)生該類(lèi)情況時(shí)，V-Control通過(guò)罐重天平的反饋，罐重低于或高于操作員預(yù)先設(shè)定的報(bào)警值，將及時(shí)發(fā)出報(bào)警提醒操作員。

三：在無(wú)反饋控制下，使用校準(zhǔn)泵進(jìn)行補(bǔ)料和收獲，但這種方法需要較多的手動(dòng)監(jiān)測(cè)和檢查，以避免反應(yīng)器內(nèi)體積的變化，所以這種方法不適用于生產(chǎn)工藝。

1 turn-key solution: V-Control

V-Control利用兩個(gè)外置的蠕動(dòng)泵和天平，通過(guò)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控調(diào)節(jié)補(bǔ)料和收獲。按給定的速率補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，而耗竭培養(yǎng)基根據(jù)浮動(dòng)的反應(yīng)器重量變化，自動(dòng)泵出。值得注意的是，即使使用*相同的泵，也不一定能提供*一致、精確的流速，而且長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行后出現(xiàn)的泵管老化現(xiàn)象會(huì)加劇這種情況。V-Control的FEED模式可以有效改善這種情況，通過(guò)在設(shè)定的時(shí)間間隔(e.g.0.5hour)計(jì)算培養(yǎng)基天平重量的變化，并與給定速率進(jìn)行比較，自動(dòng)調(diào)整補(bǔ)料泵速，減少泵及泵管帶來(lái)的誤差，精準(zhǔn)控制灌流培養(yǎng)液的流量。另外收獲泵與罐重關(guān)聯(lián)，根據(jù)浮動(dòng)的反應(yīng)器重量反饋，通過(guò)PID的調(diào)控持續(xù)調(diào)整收獲泵的速度，控制流出的培養(yǎng)液流量，將罐內(nèi)培養(yǎng)液保持在設(shè)定值，提供恒定的培養(yǎng)環(huán)境。

V-Control操作界面

由Applikon和Emerson聯(lián)合開(kāi)發(fā)的V-Control適用于灌流工藝，也可應(yīng)用于其他工藝。開(kāi)放的軟件架構(gòu)實(shí)現(xiàn)功能定制，無(wú)縫技術(shù)轉(zhuǎn)移和可放大的工藝數(shù)據(jù)。適用于實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)的反應(yīng)器以及與信息系統(tǒng)的高度整合。