廣州市艾貝泰生物科技有限公司

高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)

時(shí)間:2024-9-24 閱讀:175
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 河南省預(yù)防型疫苗工程技術(shù)研究中心,河南省生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院與河南省生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心等多個(gè)團(tuán)隊(duì)通力合作,在生物制品學(xué)雜志發(fā)表關(guān)于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)狂犬病病毒的成果,該研究為150 L生物反應(yīng)器高密度微載體工藝放大提供了技術(shù)支持,為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。


  狂犬病病毒(rabies virus, RABV)是致死率高的病毒,分布于多種哺乳動(dòng)物宿主,這些宿主與人類之間存在復(fù)雜的關(guān)系。目前,RABV引起的狂犬病每年造成約5.9萬(wàn)人死亡。迄今為止,狂犬病發(fā)病后幾乎無(wú)治愈病例,主要通過(guò)提前接種疫苗來(lái)進(jìn)行預(yù)防。我國(guó)每年人用狂犬病疫苗的消耗量約1600萬(wàn)人份。對(duì)于狂犬病疫苗的制備,RABV大規(guī)模擴(kuò)增是關(guān)鍵技術(shù),也是決定成本的重要因素之一。目前主要采用生物反應(yīng)器(借助微載體)培養(yǎng)Vero細(xì)胞,擴(kuò)增RABV,再純化病毒等步驟制備狂犬病疫苗,具有成本較低、技術(shù)較易控制等優(yōu)點(diǎn),本研究在30 L生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上,嘗試采用150 L生物反應(yīng)器、高密度微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞,擴(kuò)增RABV,以期為規(guī)?;囵B(yǎng)RABV,制備狂犬病疫苗提供參考。


  應(yīng)用30 L和150 L生物反應(yīng)器,以灌流方式培養(yǎng)Vero細(xì)胞和CTN-1V株RABV, Cytodex-1微載體濃度20 g/L,培養(yǎng)溫度36~38℃,DO 20%~60%,pH 7.0~7.4,連續(xù)13 d收獲病毒液,培養(yǎng)過(guò)程中取樣檢測(cè)細(xì)胞密度、病毒滴度,并對(duì)病毒收獲液進(jìn)行無(wú)菌和支原體檢查及抗原、宿主細(xì)胞蛋白(host cell protein, HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、DNA殘留量檢測(cè)。結(jié)果30 L和150 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)密度均可達(dá)1.2×107個(gè)/mL以上,在培養(yǎng)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.225~2.173, P=0.096~0.833)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.000, P=0.374)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液的抗原、HCP、BSA和DNA殘留量基本一致??捎?50 L生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)RABV,病毒收獲液符合《中國(guó)藥典》三部(2020版)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
 搖瓶工藝  
  搖瓶中細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí),呈致密單層,接種RABV毒種。
 生物反應(yīng)器工藝  
  細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度變化趨勢(shì)相似。細(xì)胞培養(yǎng)至第4天,密度達(dá)12.0×106個(gè)/m L以上,30 L生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度(12.3×106個(gè)/m L)高于150 L生物反應(yīng)器(12.1×106個(gè)/m L),但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.138, P=0.319)。接毒后細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間,2種規(guī)模生物反應(yīng)器細(xì)胞密度均在第6天達(dá)最高,分別為13.3×106和13.0×106個(gè)/m L。隨著病毒培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞密度呈下降趨勢(shì)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器在培養(yǎng)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.225~2.173, P=0.096~0.833)。細(xì)胞密度變化曲線見圖1;接種細(xì)胞后,細(xì)胞貼附在微載體表面,形態(tài)飽滿,無(wú)游離細(xì)胞,第4天呈致密單層,見圖2;接種病毒后,細(xì)胞逐漸發(fā)生病變,從微載體上脫落,死亡,第13天大部分細(xì)胞已脫落,見圖3。
高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
圖1
高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
圖2
高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
圖3
 病毒收獲液檢定病毒滴度變化  
  30和150 L生物反應(yīng)器中細(xì)胞感染2 d后收獲的第1組病毒液滴度平均值分別為(7.60±0.14)和(7.63±0.09)lg LD50/m L;感染4 d后,2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細(xì)胞密度均下降、收獲液病毒滴度均增加,均在感染后6 d達(dá)最高病毒滴度,且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.000, P=0.374)。隨后病毒滴度緩慢下降,培養(yǎng)結(jié)束時(shí),2種規(guī)模生物反應(yīng)器的收獲液病毒滴度均為(7.53±0.12)lg LD50/m L。見表1和圖4。表明從30 L放大至150 L的工藝可獲得高滴度的病毒收獲液。
高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
表1
高密度微載體生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)
圖4
 結(jié)果  

  搖瓶培養(yǎng)目前主要作為細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增步驟,直接應(yīng)用于規(guī)?;a(chǎn)越來(lái)越少。單個(gè)搖瓶產(chǎn)能較小,規(guī)?;a(chǎn)需至少數(shù)十個(gè)搖瓶同步進(jìn)行,導(dǎo)致人工操作復(fù)雜且強(qiáng)度大,存在一定的暴露操作風(fēng)險(xiǎn)。搖瓶培養(yǎng)技術(shù)不再是規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展方向。


  應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞是疫苗制備的關(guān)鍵技術(shù),是重要的發(fā)展方向之一。且生物反應(yīng)器易操控,適合規(guī)?;糯?,應(yīng)用反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢(shì)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率,生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作,可監(jiān)測(cè)和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量,可以更好的進(jìn)行培養(yǎng)工藝條件的篩選,優(yōu)化。工藝簡(jiǎn)單、操作靈活,有良好的適用性;培養(yǎng)工藝容易放大,可為生物體生長(zhǎng)和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境;產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,非常適合工業(yè)化生產(chǎn);管路布置較為簡(jiǎn)單,能提供較好的無(wú)菌條件,細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中不易污染。該研究在30 L生物反應(yīng)器規(guī)模實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,實(shí)現(xiàn)了在150 L生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體濃度20 g/L的Vero細(xì)胞培養(yǎng),并接種RABV,細(xì)胞病變過(guò)程正常且可控,病毒收獲液滴度最高可達(dá)8.5 lg LD50/m L, 30和150 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的終末代細(xì)胞各項(xiàng)檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》三部(2020版)要求,為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體生物反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。


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  艾貝泰深耕生物反應(yīng)器領(lǐng)域?qū)⒔?0年,立志打造自主生物反應(yīng)器。我們的生物反應(yīng)器覆蓋從研發(fā)、中試以及cGMP生產(chǎn)多 領(lǐng)域,廣泛應(yīng)用于抗體、疫苗、細(xì)胞治療、基因治療以及干細(xì)胞治療等領(lǐng)域的研發(fā)及生產(chǎn)。以生物反應(yīng)器為業(yè)務(wù)核心,我們逐步形成涵蓋過(guò)程檢測(cè)、光譜分析、細(xì)胞分析、在線取樣、樣品處理等的產(chǎn)品布局,為國(guó)內(nèi)外生物制藥企業(yè)提供了廣泛的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)。
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