PolyShooter 蛋白轉(zhuǎn)染試劑使用說明

PolyShooter^TM Protein

Transfection Reagent

For the transfection of biologically active proteins and peptides.

 Catalog Number：P19103

01/產(chǎn)品概述

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染是將生物學(xué)上有活性的蛋白質(zhì)或肽段導(dǎo)入活細(xì)胞，通過替換體內(nèi)具有缺陷或缺失的蛋白而發(fā)揮治療作用的新型手段。與傳統(tǒng)小分子化合物藥物相比，蛋白質(zhì)藥物具有更強(qiáng)的特異性和效用，在低濃度時就可以表現(xiàn)出高特異性和高活性。此外，在活細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)能夠獲得比基因轉(zhuǎn)染更迅速的蛋白表達(dá)，是核酸轉(zhuǎn)染的替代方式，可作為一種功能強(qiáng)大的研究方法或治療策略，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。

基于肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD）的技術(shù)已成功開發(fā)用于蛋白質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)染。然而，這些PTD與蛋白質(zhì)的相互作用較差，通常需要蛋白質(zhì)和PTD之間形成共價連接。目前已開發(fā)出多種試劑用于蛋白質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，如基于多肽、陽離子脂質(zhì)和聚合物的轉(zhuǎn)染試劑。這些轉(zhuǎn)染試劑主要是通過非共價相互作用與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，然后通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，這些蛋白質(zhì)復(fù)合物通常會進(jìn)入內(nèi)涵體中，如果不能及時從內(nèi)涵體中釋放，蛋白質(zhì)就會在內(nèi)涵體發(fā)展成為溶酶體后，在溶酶體中發(fā)生降解。因此，轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該有很強(qiáng)的破膜活性，從而保證轉(zhuǎn)染蛋白能夠從內(nèi)涵體中釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并發(fā)揮作用。

PolyShooter^TM Protein Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型蛋白轉(zhuǎn)染試劑，適用于幾百Da的小分子多肽到幾百kDa的大分子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的陽離子高分子轉(zhuǎn)染試劑與蛋白質(zhì)通過靜電相互作用、疏水相互作用以及氫鍵相互作用等多種非共價相互作用的協(xié)同作用與蛋白質(zhì)結(jié)合形成帶正電的復(fù)合物，之后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)涵體熟化過程中，隨著pH值的降低，陽離子高分子轉(zhuǎn)染試劑與內(nèi)涵體膜的相互作用增加，導(dǎo)致內(nèi)涵體膜的破裂，從而將蛋白質(zhì)釋放入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。由于轉(zhuǎn)染試劑通過非共價形式與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，因此不會干擾蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

PolyShooter^TM Protein Transfection Reagent對多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。另外，由于該陽離子高分子轉(zhuǎn)染試劑與蛋白質(zhì)是通過多種非共價相互作用協(xié)同結(jié)合蛋白質(zhì)的，因此可以適用于各種理化性質(zhì)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染。PolyShooter^TM Protein Transfection Reagent可用于細(xì)胞信號傳導(dǎo)和凋亡檢測、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)定位和隔室穿梭等各種功能研究。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

理想的蛋白轉(zhuǎn)染效率——針對廣泛類型的細(xì)胞，均表現(xiàn)出理想的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染效率

蛋白活性高——與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合，遞送后的蛋白和肽仍具有高生物學(xué)活性

細(xì)胞毒性低——作用溫和，生物相容性好

操作簡單——簡單快速的實(shí)驗(yàn)方案，無需分離、克隆和轉(zhuǎn)染基因序列；孵育后3-12小時內(nèi)可獲得穩(wěn)定的蛋白轉(zhuǎn)染效果

適用范圍廣——適用于各種理化性質(zhì)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染

05/適用范圍

PolyShooter^TM Protein Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型蛋白轉(zhuǎn)染試劑，對多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，適用于幾百Da的小分子多肽到幾百kDa的大分子蛋白質(zhì)及各種理化性質(zhì)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染。

06/實(shí)驗(yàn)流程概要

07/實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將胰酶消化后的細(xì)胞按照每孔1-3x10⁵個細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為50%-100%。

懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物之前，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入2-6x10⁵個細(xì)胞。

? 細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2: 準(zhǔn)備PolyShooter^TM Protein轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物

（1）取1-10 μg 蛋白質(zhì)加入到1.5 mL離心管中，加入1-3 μL PolyShooter^TM Protein轉(zhuǎn)染試劑與蛋白質(zhì)混合，室溫孵育3分鐘。

? 蛋白質(zhì)的實(shí)際使用量需根據(jù)蛋白質(zhì)的類型和具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)使用量相差較大，例如：熒光蛋白EGFP建議24孔板使用量為5-10 μg，熒光蛋白Phycoerythrin建議24孔板使用量為0.5-2 μg，凋亡蛋白Saporin建議24孔板使用量為0.1-1 μg。

? 轉(zhuǎn)染試劑的用量應(yīng)根據(jù)目的細(xì)胞類型、接種細(xì)胞密度、培養(yǎng)皿的大小進(jìn)行調(diào)整，請參見表一。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基¹（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

（3）20分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物中加入400 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基²（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗）稀釋復(fù)合物。

3: 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染

棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞1-2次，將上述500 µL轉(zhuǎn)染試劑-蛋白復(fù)合物加入每孔細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染。

4. 分析蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染效果

轉(zhuǎn)染試劑-蛋白復(fù)合物與細(xì)胞孵育3-12小時后，可根據(jù)實(shí)際情況，用熒光檢測法、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行后續(xù)檢測及分析。

表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)

08/注意事項(xiàng)

1. 蛋白質(zhì)質(zhì)量：蛋白質(zhì)中存在的雜質(zhì)、污染物和添加劑都可能會影響蛋白質(zhì)遞送效率，我們建議使用盡可能高純度的蛋白質(zhì)樣品。

2. 細(xì)胞質(zhì)量：細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3. 細(xì)胞密度：建議細(xì)胞傳代后12-24 h內(nèi)、細(xì)胞密度為50%-100% 時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不同的蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同蛋白質(zhì)或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中需保證相同的接種條件，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。

4.蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)染試劑使用量：蛋白質(zhì)的實(shí)際使用量需根據(jù)蛋白質(zhì)的類型和具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)使用量相差較大。轉(zhuǎn)染試劑的用量應(yīng)根據(jù)目的細(xì)胞類型、接種細(xì)胞密度、培養(yǎng)皿的大小進(jìn)行調(diào)整（參見表一）。想要獲得理想的蛋白遞送效果，需對蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)染試劑的使用量進(jìn)行優(yōu)化，選擇適合的劑量。

5. 采用無血清轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染可獲得高效的蛋白質(zhì)遞送效果，這是因?yàn)檠逯械难宓鞍讜ㄟ^競爭結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染試劑，從而影響轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性。

6. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM Protein Transfection Reagent的相容性。

7. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

8. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天，將CHO、NIH-3T3、H1299和HEK293細(xì)胞分別接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時密度約為95%。

2: 按照每孔計量，取10 μg EGFP（1mg/mL）蛋白加入到1.5 mL離心管中，再分別加入1 μL、2 μL、3 μL PolyShooter^TM Protein Transfection Reagent與蛋白質(zhì)混合，室溫孵育3 min。

3: 往混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置20 min，形成轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

4: 20分鐘后，往復(fù)合物中加入400 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物。

5: 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞2次，將上述500 µL轉(zhuǎn)染試劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，與細(xì)胞孵育4小時。

6: 轉(zhuǎn)染4小時后，用熒光顯微鏡檢測EGFP綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

10/其他相關(guān)產(chǎn)品